哈維氏弧菌的密度感應(yīng)系統(tǒng)及其信號(hào)干擾研究.pdf

1、密度感應(yīng)(quorum sensing)是細(xì)菌間通過分泌信號(hào)來(lái)控制特定基因表達(dá)的一種機(jī)制。在一些病原菌中，一些毒力基因的表達(dá)是受密度感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控的。哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)是一種革蘭氏陰性、發(fā)光的海洋細(xì)菌，是海洋環(huán)境的正常菌群。近些年，哈維氏弧菌成為海水養(yǎng)殖動(dòng)物(魚、蝦)的重要致病菌，給海水養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。傳統(tǒng)上使用抗生素來(lái)對(duì)抗哈維氏弧菌引起的感染，這給海洋環(huán)境及人類健康造成了極大的危害，因此急需找到一種新

2、的抗感染策略。哈維氏弧菌的某些致病因子是受密度感應(yīng)系統(tǒng)控制的，因此破壞哈維氏弧菌的密度感應(yīng)系統(tǒng)是一種新的抗感染的思路。 本研究從多個(gè)哈維氏弧菌菌株中篩選到三株發(fā)光菌株VIB391、VIB295和E022，對(duì)其在固體和液體培養(yǎng)基上的發(fā)光情況進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，在不同狀態(tài)的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)不影響發(fā)光菌株的相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度，以VIB391最強(qiáng)，E022次之，VIB295最弱；在平板上生長(zhǎng)時(shí)發(fā)光時(shí)間持續(xù)最長(zhǎng)，而在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)發(fā)光強(qiáng)度均

3、勻，變化明顯，有利于實(shí)驗(yàn)觀察。 通過對(duì)哈維氏弧菌密度感應(yīng)系統(tǒng)不同部位突變株的胞外酶(如蛋白酶、脂酶、磷脂酶和溶血素等)的活性進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，明膠酶的活性受密度感應(yīng)系統(tǒng)的信號(hào)分子HAI-1和AI-2的正控制，且受AI-2的控制程度更大；脂酶也在一定程度上受HAI-1和AI-2的正控制；卵磷脂酶受HAI-1的負(fù)控制；溶血素受HAI-1和AI-2共同的負(fù)控制。 從GenBank中獲取哈維氏弧菌中編碼AI-2合成酶的luxS基因序

4、列設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物從哈維氏弧菌VIB645中PCR擴(kuò)增luxS基因，將luxS基因克隆于pUC載體并測(cè)序，發(fā)現(xiàn)其與GenBank中已發(fā)表的哈維氏弧菌的luxS基因序列相似性為90％，證明LuxS/AI-2系統(tǒng)在哈維氏弧菌不同的菌株中的具有一定的特異性，推測(cè)LuxS/AI-2系統(tǒng)可能與哈維氏弧菌的致病性或發(fā)光現(xiàn)象有關(guān)。對(duì)哈維氏弧菌VIB645luxSi基因序列的進(jìn)一步分析表明，該基因總長(zhǎng)519bp，編碼172個(gè)氨基酸，分子量19.08k

5、Da，理論等電點(diǎn)為5.07，分子式C<,834>H<,1335>N<,229>O<,260>S<,11>且這種蛋白不穩(wěn)定，半衰期約20h左右。為進(jìn)一步研究LuxS的結(jié)構(gòu)和特征奠定基礎(chǔ)。進(jìn)一步的核苷酸進(jìn)化分析表明，哈維氏弧菌VIB645 luxS基因的序列與GenBank公布的其它luxS基因序列都有較大的差別。16SrRNA序列系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，哈維氏弧菌和生黃瘤胃球菌(Ruminococus flavefaciens)及反芻瘤胃亞菌

6、(Prevotella ruminicola)在種屬上都有較大的差異，而哈維氏弧菌個(gè)別菌株的luxS序列與生黃瘤胃球菌和反芻瘤胃亞菌的luxS序列卻有很高的同源性，推測(cè)LuxS/AI-2系統(tǒng)可能是通過基因水平傳播而獲得的，與系統(tǒng)進(jìn)化的關(guān)系不大。許多水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物病原菌毒力因子的表達(dá)與密度感應(yīng)系統(tǒng)有關(guān)，某些芽孢桿菌屬細(xì)菌產(chǎn)生的AiiA蛋白可降解密度感應(yīng)病原菌的AHL信號(hào)分子，從而可能作為一種新的抗病蛋白用于對(duì)病原菌的控制。本研究根據(jù)幾種芽孢

7、桿菌的aiiA基因序列的保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，從蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringensis)BF1中擴(kuò)增出aiiA基因，將aiiA基因克隆于pUC載體并測(cè)序，其開放閱讀框?yàn)?53 bp。經(jīng)Blast同源比對(duì)，其序列與己發(fā)表的蘇云金芽胞桿菌aiiA基因序列的相似性為99％。進(jìn)一步將aiiA基因克隆于pET-24d(+)表達(dá)質(zhì)粒，AiiA蛋白作為一種帶六組氨酸的融合蛋白在大腸桿菌BL21(DE3)中得到了大量表達(dá)。SDS-PAGE

8、分析表明，表達(dá)蛋白的分子量約為28 kDa。在37、25和17℃時(shí)，重組的AiiA蛋白都能得到較好的表達(dá)，并且在25℃培養(yǎng)6 h時(shí)表達(dá)的最好。將表達(dá)的重組菌體經(jīng)超聲波破碎后，取其上清液作用于紫色色桿菌(Chromobacterium violaceum)ATCC 12472，使其受密度感應(yīng)系統(tǒng)控制的紫色色素的合成受到抑制；又用上清液分別作用于哈維氏弧菌的發(fā)光菌株VIB391和BB886，可使其發(fā)光強(qiáng)度分別減弱68％和53％。本研究為進(jìn)一