應(yīng)激對黃顙魚非特異性免疫細胞的影響.pdf

1、本研究首次系統(tǒng)地開展了應(yīng)激對黃顙魚非特異性免疫細胞影響的研究。采用光鏡和電鏡技術(shù)，對黃顙魚外周血細胞的組成與結(jié)構(gòu)，以及黃顙魚頭腎的組織發(fā)生與組織細胞結(jié)構(gòu)進行了觀察；以血清皮質(zhì)醇為主要指標，監(jiān)測了運輸應(yīng)激對外周血白細胞百分比和功能的影響；采用Percoll連續(xù)密度梯度離心法分離出黃顙魚頭腎巨噬細胞，對其顯微、超顯微結(jié)構(gòu)與吞噬功能進行了觀察，并進一步研究了外源皮質(zhì)醇、巨噬細胞活化因子(MAF)、脂多糖(LPS)對頭腎巨噬細胞呼吸爆發(fā)功能的影

2、響；采用人工注射液體石蠟誘導腹腔炎癥的方法，觀察了黃顙魚腹腔滲出細胞的類型及炎癥過程中各類細胞相對數(shù)量和功能的變化特征，并進一步研究了外源皮質(zhì)醇對腹腔滲出細胞數(shù)量與功能的影響。此外，還觀察和研究了外源皮質(zhì)醇對黃顙魚幼魚生長與外周血細胞數(shù)量的影響。 1.在血涂片上可鑒別出紅細胞、血栓細胞、淋巴細胞、嗜中粒細胞和單核細胞，電鏡觀察可確認這5種細胞類型。血涂片上還觀察到幼紅細胞及正在分裂的紅細胞。血栓細胞是數(shù)量僅次于紅細胞的血細胞，在

3、白細胞分類計數(shù)中占78％。淋巴細胞是核質(zhì)比最高的血細胞，在白細胞分類計數(shù)中占17.5％。一種與斑點叉尾鲴非特異性細胞毒性細胞(NCC)相似的淋巴細胞被觀察到。嗜中粒細胞是所觀察到的唯一一種有粒細胞，是最大的白細胞，在白細胞分類計數(shù)中占3.7％。在嗜中粒細胞中只觀察到一種含有絲狀內(nèi)涵物的特殊顆粒，呈橢圓狀或桿狀。單核細胞在白細胞分類計數(shù)中不超過1％。 2.運輸后的黃顙魚在最初4～7d內(nèi)，明顯的行為變化是停止攝食。所有的魚從第8d開

4、始恢復(fù)了攝食，從第15d開始適應(yīng)了日常管理活動。血液皮質(zhì)醇和血糖濃度在剛剛運抵實驗循環(huán)系統(tǒng)(0d)及第1d，2d，3d的魚體內(nèi)顯著升高，至第7d已顯著下降，并在第21d，28d，35d穩(wěn)定在低水平上。外周血紅細胞數(shù)量沒有顯著變化。與第21d，28d，35d外周血白細胞的各參數(shù)值相比，淋巴細胞百分比在第3d，7d顯著減少，嗜中粒細胞百分比在0d，1d，2d，3d顯著升高，吞噬細胞吞噬百分比和吞噬指數(shù)在第7d，14d顯著降低。以上結(jié)果顯示(

5、1)運輸使黃顙魚成魚產(chǎn)生典型的應(yīng)激反應(yīng)；(2)運輸應(yīng)激導致黃顙魚成魚外周血淋巴細胞和嗜中粒細胞百分比的顯著改變和外周血白細胞吞噬功能的抑制；(3)運輸應(yīng)激后的池養(yǎng)黃顙魚成魚在本文使用的實驗循環(huán)系統(tǒng)中充分恢復(fù)和馴化所需的最少時間是3周。 3.出膜后1d，頭腎僅由腎小管組成；出膜后2d，頭腎小管間出現(xiàn)未分化的細胞團；出膜后7d，頭腎小管間出現(xiàn)淋巴細胞團；此后淋巴細胞及造血細胞的數(shù)量逐漸增多；出膜后26d至43d，腎小管逐漸萎縮直至完

6、全消失，頭腎完成由排泄器官向淋巴器官的轉(zhuǎn)變。黃顙魚頭腎不具有被膜，含豐富的靜脈血管、血竇以及處于不同發(fā)育時期的各類免疫細胞。腎上腺組織細胞分布于頭腎門靜脈以及頭腎組織中靜脈管周邊。黃顙魚幼魚頭腎所含酸性顆粒細胞較成魚頭腎豐富，黃顙魚成魚頭腎則具有較多的黑色素巨噬細胞，且常常在血管附近聚集形成黑色素巨噬細胞中心。黃顙魚頭腎免疫細胞的主要超微特征如下：細胞核質(zhì)比和線粒體數(shù)量在淋巴細胞中差異較大。一種粒細胞及其所含特殊顆粒與外周血嗜中粒細胞相

7、同；另一種粒細胞及其所含特殊顆粒與其他研究報道的魚類嗜酸性顆粒細胞(EGC)或肥大細胞相同。單核細胞和巨噬細胞都含有豐富的溶酶體及線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細胞器，后者則根據(jù)功能狀態(tài)的不同含有大小數(shù)量不等的吞噬泡。黑色素巨噬細胞含有極不規(guī)則的顆粒，顆粒具指紋特征。 4.每尾黃顙魚可分離出1.2-1.6mL 濃度為1×10<'7>cells/mL的高純度頭腎巨噬細胞；培養(yǎng)3h-18h后，貼壁純化的頭腎巨噬細胞達到95-98％；分離培養(yǎng)的

8、頭腎巨噬細胞具有巨噬細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征，對福爾馬林滅活金黃色葡萄球菌(F-SA)的吞噬率達95％以上。PMA刺激分離的頭腎巨噬細胞產(chǎn)生顯著的呼吸爆發(fā)活動。在較高濃度和較長作用時間情況下，外源皮質(zhì)醇對黃顙魚體內(nèi)外頭腎巨噬細胞的呼吸爆發(fā)均產(chǎn)生抑制作用。 5.采用ConA(10μg/mL)與PMA(10ng/mL)聯(lián)合刺激單尾黃顙魚頭腎白細胞所制備的含巨噬細胞活化因子(MAF)上清液經(jīng)1：4稀釋后與頭腎巨噬細胞孵育24h，能顯著提高細

9、胞的呼吸爆發(fā)活動。濃度分別為12.5、25、50μg/mL的LPS與頭腎巨噬細胞孵育24h，對細胞的呼吸爆發(fā)活動都有顯著的促進作用，且濃度越高促進作用越顯著。 6.腹腔注射液體石蠟后黃顙魚腹腔滲出細胞主要包括嗜中粒細胞、巨噬細胞和嗜酸性顆粒細胞(EGC)。注射后2d，腹腔滲出細胞以嗜中性粒細胞為主(占嗜中粒細胞和巨噬細胞總數(shù)的61±1.1％)，注射后6d、10d則以巨噬細胞為主(在嗜中粒細胞、巨噬細胞和EGC分類計數(shù)中分別占77

10、.8±2.8％和82.3±1.1％)，注射后6d出現(xiàn)EGC，隨后數(shù)量逐漸增加。炎癥過程中吞噬細胞(包括腹腔滲出嗜中粒細胞和巨噬細胞)對福爾馬林滅活金黃色葡萄球菌(F-SA)的吞噬率和硝基四氮唑藍(NBT)反應(yīng)陽性細胞率逐漸上升。皮質(zhì)醇混飼投喂使注射液體石蠟后6d腹腔滲出巨噬細胞百分比和吞噬細胞的吞噬率顯著下降，EGC百分比顯著上升。 7.外源皮質(zhì)醇混飼投喂(100mg/kg飼料)5周使黃顙魚幼魚增重顯著受阻，使外周血白細胞數(shù)量顯