衣霉素激活心肌細(xì)胞氯通道的電生理特性及與ROS的關(guān)系.pdf

1、由于心肌的不可再生性,使得如何減少疾病狀態(tài)下心肌細(xì)胞的損失成為研究的焦點(diǎn)。而凋亡被認(rèn)為是多種心臟疾病過(guò)程中,心肌細(xì)胞死亡的重要形式。目前研究表明心肌細(xì)胞凋亡時(shí),隨著細(xì)胞內(nèi)K+、Cl-和水的外流,細(xì)胞會(huì)發(fā)生皺縮,這一現(xiàn)象被稱(chēng)為凋亡性容積減小(apoptoticvolumedecrease,AVD)[1]。而在AVD過(guò)程中,容積敏感外向整流氯離子通道(volume-sensitivechloridechannel,VSOR)被認(rèn)為是負(fù)載氯離

2、子外流的主要通道,該通道電流又稱(chēng)為容積敏感氯電流(volume-sensitiveCl-current,ICl,Vol)[1],其電生理學(xué)特征主要包括:?外向整流;?高正電壓依賴性失活;?對(duì)氯通道阻斷劑DIDS敏感。目前有關(guān)細(xì)胞凋亡的途徑一共有三條,分別為①線粒體途徑;②死亡受體途徑;③內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[2],運(yùn)用細(xì)胞凋亡線粒體途徑和死亡受體途徑經(jīng)典的激活劑STS和TNF-α均可以激活VSOR,同時(shí)介導(dǎo)STS激活VSOR電流的調(diào)

3、節(jié)分子為活性氧(ROS)。然而,凋亡的另一條重要途徑,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmicreticulumstress,ERS)過(guò)程中是否有VSOR的參與,目前尚未見(jiàn)有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。我們前期發(fā)現(xiàn),VSOR通道的阻斷劑4,4'-二異硫氰基芪-2,2'-二磺酸(4,4'-diisothiocyanostilbene2,2'-disulfonicacid,DIDS)可以減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的誘導(dǎo)劑衣霉素(Tunicamycin,Tm)造成的心肌細(xì)胞

4、凋亡。為此我們假設(shè)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡過(guò)程中也許VSOR同樣發(fā)揮著重要作用。本研究正是基于前期工作的基礎(chǔ)上,擬應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù),觀察在Tm處理心肌細(xì)胞時(shí)記錄的細(xì)胞膜電流是否符合VSOR的電生理學(xué)特征,并探討ROS是否是衣霉素激活VSOR的調(diào)節(jié)分子。
　　研究目的:
　　1.觀察衣霉素是否能夠誘導(dǎo)心肌細(xì)胞產(chǎn)生電生理學(xué)特征符合VSOR的氯電流。
　　3.觀察在衣霉素激活心肌細(xì)胞膜VSOR電流中是否有ROS的參

5、與。
　　研究方法:
　　1.原代心肌細(xì)胞的培養(yǎng)及分組:常規(guī)獲取SD大鼠新生鼠(0-3Day)心肌細(xì)胞,進(jìn)行原代爬片培養(yǎng)心肌細(xì)胞12小時(shí),供膜片鉗使用。實(shí)驗(yàn)設(shè)立陰性對(duì)照組(等滲組),正常對(duì)照組(低滲組),以及實(shí)驗(yàn)組(等滲+Tm組)每組相同實(shí)驗(yàn)重復(fù)5個(gè)細(xì)胞及以上。
　　2.膜片鉗全細(xì)胞電生理技術(shù):應(yīng)用膜片鉗全細(xì)胞技術(shù)觀察低滲及含Tm的等滲外液灌流細(xì)胞時(shí),進(jìn)行電流的記錄及觀察其電生理學(xué)特征。
　　3.ROS的干預(yù):利

6、用ROS的清除劑NAC預(yù)處理后觀察Tm對(duì)心肌細(xì)胞誘導(dǎo)VSOR電流的影響及H2O2處理心肌細(xì)胞后,觀察心肌細(xì)胞膜電流的改變。
　　研究結(jié)果:
　　1.低滲外液灌流心肌細(xì)胞發(fā)現(xiàn)全細(xì)胞氯電流的幅度明顯增加,+100mv時(shí)的電流密度為12.22±1.31pA/pF(n=5,P<0.05,低滲組vs等滲組),且存在正電壓依賴性失活的特征。同時(shí),I-V關(guān)系曲線表明其具有較顯著的外向整流的特征。當(dāng)?shù)蜐B誘導(dǎo)的VSOR電流達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)時(shí),利用

7、含有DIDS的低滲外液灌流心肌細(xì)胞并記錄電流。發(fā)現(xiàn)DIDS可以顯著降低低滲誘導(dǎo)電流的幅度,在+40mv,+60mv,+80mv,+100mv時(shí)抑制作用最為明顯,同時(shí)I-V曲線顯示其外向整流的特征被減弱了,以上電生理學(xué)特征均符合VSOR。
　　2.與等滲外液灌流誘導(dǎo)的低幅度基礎(chǔ)氯電流相比,當(dāng)用含有Tm的等滲外液灌流心肌細(xì)胞同樣可以顯著地增加氯電流的幅度,+100mv時(shí)電流密度為13.26±1.15pA/pF(n=5,P<0.05,衣

8、霉素組vs等滲組),并且表現(xiàn)出較明顯的正電壓依賴性失活,以及外向整流的特征。從I-V曲線可以看出在+40、+60、+80及+100mv時(shí)電流幅度增加尤甚。而DIDS同樣可以顯著的抑制該電流的幅度以及相關(guān)電生理特征。證明Tm可以激活心肌細(xì)胞上的全細(xì)胞氯電流的電生理學(xué)特征與低滲誘導(dǎo)的VSOR電流類(lèi)似。
　　3.利用含有NAC(10mmol)的等滲外液灌流細(xì)胞,可以發(fā)現(xiàn)僅有幅度較小的基礎(chǔ)電流。然而,當(dāng)使用含有NAC+Tm的等滲灌流液灌流

9、細(xì)胞時(shí)卻未發(fā)現(xiàn)全細(xì)胞氯電流幅度的明顯增加(n=5,P<0.05,NAC+TmvsTm)。表明NAC可以顯著地抑制Tm誘導(dǎo)的VSORCl-電流的產(chǎn)生。細(xì)胞外應(yīng)用H202可以直接激活Cl-電流,+100mv時(shí)電流密度為13.99±1.23pA/pF(n=5,P>0.05,TmvsH202),同Tm以及低滲誘導(dǎo)的Cl-電流特征相似。提示ROS參與了Tm誘導(dǎo)的VSOR激活。
　　結(jié)論:
　　1.低滲可以誘導(dǎo)心肌細(xì)胞產(chǎn)生VSOR電流,