蓖麻油抗雌鼠生育作用活性物質(zhì)的分離、分析及作用機(jī)理研究.pdf

1、鼠害是農(nóng)業(yè)生物災(zāi)害中的主要災(zāi)種之一，是當(dāng)今世界性災(zāi)害，給農(nóng)業(yè)、林業(yè)、畜牧業(yè)等造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。有效控制鼠害是保障農(nóng)林牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前，國(guó)內(nèi)外鼠害防治以化學(xué)防治為主，主要是通過(guò)增加鼠的死亡率來(lái)控制害鼠的種群數(shù)量，但均無(wú)持效性，且滅鼠后的低密度時(shí)間最長(zhǎng)僅維持一年左右，此后鼠密度逐漸上升而恢復(fù)至原有水平；傳統(tǒng)滅鼠劑還存在對(duì)環(huán)境和其它生物有毒副作用和成本高等弊端。鑒于傳統(tǒng)滅鼠措施存在的不足，一種新的鼠害控制策略逐漸受到重視，即

2、從保持生態(tài)平衡的角度出發(fā)，尋求一種控制鼠類(lèi)出生率的植物性不育劑，通過(guò)降低鼠類(lèi)群體的繁殖率而實(shí)現(xiàn)降低群體密度，從而達(dá)到從根本上控制鼠害的目的，且對(duì)人類(lèi)和其他動(dòng)物、環(huán)境安全無(wú)害，效果持久。 有關(guān)不育對(duì)鼠類(lèi)種群繁殖力和數(shù)量影響的研究表明：不育能夠取得滅殺的效果，若考慮不育的干擾作用，不育方法比滅殺更能控制鼠類(lèi)種群數(shù)量的增加；單性不育控制鼠害的實(shí)驗(yàn)表明，雌性不育比雄性不育效果好，而雙性不育比單性不育效果更好。在近年來(lái)興起的植物不育劑的研

3、究和開(kāi)發(fā)中，許多植物源不育劑是針對(duì)抗雄鼠生育的，而抗雌鼠生育的植物不育劑的研究和開(kāi)發(fā)卻較少見(jiàn)。其主要原因是在雌性不育劑有效成分的研發(fā)過(guò)程中，作為導(dǎo)向分離的篩選靶標(biāo)較難確定，造成篩選抗生育有效成分難度比較大。 蓖麻油是大戟科植物蓖麻(Ricinus communis L.)種子的乙醚提取物(AEC)。在我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中，蓖麻油具有瀉下通滯、消除癰疽腫毒、導(dǎo)瀉等功能；臨床上用蓖麻油抄雞蛋進(jìn)行催產(chǎn)已有多年的歷史；在印度、朝鮮、約旦等國(guó)和

4、一些非洲國(guó)家，婦女常常服用蓖麻籽及其提取物來(lái)進(jìn)行避孕。有研究表明，蓖麻油具有抗雌鼠和雄鼠生育的作用，且其抗生育活性較強(qiáng)。為了研制新型的鼠類(lèi)不育劑，本研究對(duì)蓖麻油抗雌鼠生育作用和作用機(jī)理進(jìn)行了研究，建立了抗雌鼠生育活性物質(zhì)的體外篩選方法，導(dǎo)向分離出具有較強(qiáng)抗雌鼠生育活性的晶體物質(zhì)，并對(duì)這一抗雌鼠生育活性晶體物質(zhì)進(jìn)行了分析。本論文研究的結(jié)果既為開(kāi)發(fā)高效、安全的植物源抗鼠生育藥物提供有效藥源，又為我國(guó)蓖麻資源的綜合利用開(kāi)辟了新途徑，有利于提高

5、蓖麻產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)效益與社會(huì)效益；有利于為創(chuàng)制與環(huán)境相容的高效植物源生物鼠不育劑、開(kāi)發(fā)出具有我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新型植物源農(nóng)藥，奠定堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。本論文主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下： 1、通過(guò)用蓖麻油在特定的時(shí)間內(nèi)連續(xù)灌胃小鼠，統(tǒng)計(jì)懷孕和胚胎數(shù)量，研究蓖麻油的抗早孕、抗著床作用。結(jié)果表明：20 mg/kg/d處理組小鼠受孕率降低不明顯，但是小鼠所孕胎兒總數(shù)有一定的減少；40 mg/kg/d及其以上濃度的兩個(gè)處理濃度小鼠受孕率明顯降低，其生育

6、抑制率分別達(dá)到：72.2％、88.2％和90％(與對(duì)照組比較，p<0.01)，個(gè)體所孕的胎兒數(shù)也明顯減少；蓖麻油對(duì)小鼠的生育抑制作用有一定的量.效關(guān)系：在抗著床方面，40mg/kg/d、80mg/kg/d和160 mg/kg/d三個(gè)處理組的子宮內(nèi)著床位點(diǎn)明顯減少，著床率明顯降低，分別為：3/8、1/6和1/6；在抗早孕方面，從40 mg/kg/d處理濃度開(kāi)始，小鼠懷孕率明顯降低，生育抑制率顯著提高；小鼠懷孕的胎兒數(shù)隨著處理濃度的增加而減

7、少；此外，蓖麻油處理組卵巢和免疫系統(tǒng)主要的器官脾和腎上腺指數(shù)變化不明顯，但從40 mg/kg/d處理濃度開(kāi)始，小鼠胸腺增大、胸腺指數(shù)增加。隨著處理濃度的加大，胸腺指數(shù)增加得越顯著(p<0.01)。 2、采用灌胃蓖麻油后對(duì)小鼠動(dòng)情周期、妊娠相關(guān)蛋白-A(pregnancy- associated plasma protein A，PAPP-A)和雌二醇(E2)、孕酮(P)等性激素水平，以及蓖麻油引起的未懷孕體質(zhì)健壯小鼠的卵巢、輸卵

8、管和子宮結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行研究，探討蓖麻油抗生育活性的作用機(jī)理。結(jié)果表明：20mg/kg/d劑量蓖麻油處理組小鼠動(dòng)情期的時(shí)間和表現(xiàn)與對(duì)照組比較均無(wú)明顯區(qū)別；而40mg/kg/d及其以上處理組小鼠在動(dòng)情期生理特征不明顯，動(dòng)情期縮短，動(dòng)情周期延長(zhǎng)，主要是動(dòng)情間期延長(zhǎng)且不規(guī)則。小鼠血清中的雌二醇(E2)水平無(wú)明顯變化，而孕酮(P)含量有一定的升高；在20mg/kg/d處理組，小鼠血漿中的PAPP.A稍微低于對(duì)照組；而從40 mg/kg/d處理劑量開(kāi)

9、始，PAPPA值降低顯著；且隨著蓖麻油處理濃度的增加，PAPP-A值降低程度增大；蓖麻油40mg/kg/d劑量處理組和以上濃度劑量處理組膨大子宮與正常對(duì)照未孕雌鼠子宮相比，其內(nèi)腔擴(kuò)大，子宮壁明顯變??；肌肉層比對(duì)照組薄，肌纖維排列疏松、紊亂；子宮基質(zhì)層較薄，其內(nèi)腺體減少；黏膜上皮增厚。 3、通過(guò)用不同劑量蓖麻油處理原代培養(yǎng)大鼠蛻膜細(xì)胞和黃體細(xì)胞，觀察細(xì)胞形態(tài)變化，同時(shí)用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力，確定了蓖麻油抗雌鼠生育活性成分的作用靶標(biāo)

10、，首次建立蓖麻油抗生育有效成分的體外篩選方法。結(jié)果表明：400μg/mL及其以上濃度蓖麻油處理液對(duì)體外培養(yǎng)大鼠蛻膜細(xì)胞形態(tài)有明顯的影響，400μg/mL蓖麻油處理液使部分離體培養(yǎng)蛻膜細(xì)胞體積比正常細(xì)胞明顯減小、細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)明顯空泡，部分細(xì)胞胞漿皺縮、死亡。MTT法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：400μg/mL及其以上處理濃度的蓖麻油對(duì)蛻膜細(xì)胞的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用(p<0.05)；蓖麻油對(duì)蛻膜細(xì)胞的半抑制濃度(IC<,50>)為568.6±5.3μg/mL，

11、r=+0.9790；且這一抑制作用具有良好的量-效關(guān)系。而蓖麻油對(duì)黃體細(xì)胞活力的抑制作用不顯著，僅僅表現(xiàn)在600μg/mL濃度蓖麻油處理24h的大鼠黃體細(xì)胞體積變小，細(xì)胞數(shù)量有些許減少。用大鼠離體培養(yǎng)蛻膜細(xì)胞的活力測(cè)定方法作為蓖麻油抗雌鼠生育有效成分分離、提純的活性跟蹤指標(biāo)是可行的。 4、以原代培養(yǎng)大鼠蛻膜細(xì)胞(DSC)活力作為篩選靶標(biāo)，首次導(dǎo)向分離蓖麻油(AEC)中的抗生育活性成分。經(jīng)過(guò)皂化、乙醚萃取、乙醇重結(jié)晶和活力檢測(cè)等步

12、驟，獲得一種對(duì)大鼠蛻膜細(xì)胞活力有抑制作用的無(wú)色晶體，其半抑制濃度(IC<,50>)為63.84±3.04μg/mL，r=+0.9478。GC-MS分析和計(jì)算機(jī)相似性比較表明：無(wú)色晶體由5種成分組成，其中有4成分為植物甾醇。 5、種成分分別是：麥角甾-5-稀-3-醇(Ergost-5-en-3-ol)，豆甾醇(Stigmasterol)，γ-谷甾醇(γ-Sitosterol)、巖藻甾醇(Fucosterol)，和普羅布考(Prob

13、ucol)類(lèi)似物等。其中γ-谷甾醇(γ-Sitosterol)的含量最高，達(dá)44.77％；其余組分的含量分別是：豆甾醇(Stigmasterol)占35.80％，巖藻甾醇(Fucosterol)占8.40％，麥角甾-5-稀-3-醇(Ergost-5-en-3-ol)占6.10％和普羅布考(Probucol)類(lèi)似物占4.93％。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果和文獻(xiàn)報(bào)道推測(cè)：γ-谷甾醇(γ-Sitosterol)很有可能是抑制離體培養(yǎng)大鼠蛻膜細(xì)胞活力的主要成