紅法夫酵母發(fā)酵生產(chǎn)蝦青素及其代謝調(diào)控研究.pdf

1、蝦青素(3,3’-二羥基-β,β’-胡蘿卜素-4,4’-二酮) 是一種重要的類胡蘿卜素，具有優(yōu)良的色素沉積作用并能促進動物發(fā)育，更具有超強的抗氧化活性及較強抗腫瘤活性。由于化學(xué)合成的蝦青素在應(yīng)用和安全性上的局限，人們對天然來源蝦青素需求量越來越大，而利用微生物(如紅法夫酵母)發(fā)酵生產(chǎn)蝦青素是當(dāng)前研究的熱點。紅法夫酵母是唯一能利用多種碳氮源并積累蝦青素為主要類胡蘿卜素的酵母，本文首先采用各種物化因子對紅法夫酵母原始菌株進行誘變，獲得了蝦青

2、素高產(chǎn)突變株，研究了該突變株生產(chǎn)蝦青素的發(fā)酵條件，建立了蝦青素檢測的快速方法和類胡蘿卜素大規(guī)模提取方法，并進行了不同發(fā)酵規(guī)模培養(yǎng)條件的研究，進行了基于紅法夫酵母蝦青素生物合成途徑的代謝調(diào)控研究。 本文采用各種物化因子如紫外線(UV)、甲基磺酸乙酯(EMS)和60 Co γ射線多次誘變紅法夫酵母原始菌株，獲得了一株穩(wěn)定高產(chǎn)蝦青素的突變株，隨后在搖瓶條件下對此菌株的發(fā)酵條件進行了研究。種子、通氣量、溫度和pH 值影響紅法夫酵母生長、

3、類胡蘿卜素和蝦青素的合成，種齡為48 h 的種子在接種量為9 ％、搖床轉(zhuǎn)速為250 rmin –1 、250 ml 三角瓶裝液量為30 ml 、培養(yǎng)溫度為16~18 ℃、培養(yǎng)基初始pH 值為5.0時有利于發(fā)酵。研究了培養(yǎng)基成分如碳源、氮源和無機鹽對生長、類胡蘿卜素和蝦青素合成的影響，并對培養(yǎng)基成分進行了優(yōu)化，最佳培養(yǎng)基為(g l -1 ): 葡萄糖30 、蔗糖30 、酵母浸粉6 、(NH4)2SO4 3 、KH2PO42 、Na2HPO

4、4 1 、MgSO4 5 。研究了蝦青素快速和大規(guī)模提取條件，采用二甲基亞砜對濕菌體直接提取類胡蘿卜素后492nm 處比色測定是一種快速的蝦青素近似定量方法。在優(yōu)化破壁條件即50 ℃用4M 的鹽酸和6 ml 的溶菌酶處理8 h ，然后中和到pH 值為3.0 ，再經(jīng)噴霧干燥，用丙酮提取類胡蘿卜素，提取率最高達到99. 23 ％。 隨后對紅法夫酵母生物反應(yīng)器間歇發(fā)酵培養(yǎng)工藝進行了研究，進行了5 L 、100 L 、2000 L 、1

5、5000 L 等不同規(guī)模發(fā)酵放大實驗，發(fā)酵工藝研究主要在5 L 全自動罐中進行。結(jié)果表明攪拌轉(zhuǎn)速、通氣量對溶氧、生長和產(chǎn)物合成有著顯著影響，當(dāng)攪拌速度為300 r min -1 、通氣量為1.5vvm 時發(fā)酵結(jié)果最佳。研究了補水工藝和氧載體對發(fā)酵和溶解氧水平的影響，結(jié)果表明在大量少次補水、二甲基硅油為氧載體添加量為2％時最佳。進行的紅法夫酵母15000 L 規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)尚未見報道。結(jié)果表明發(fā)酵罐規(guī)模越大，發(fā)酵周期越短，推斷氧的供給是紅法

6、夫酵母發(fā)酵產(chǎn)蝦青素的一個重要影響因子。 基于紅法夫酵母蝦青素生物合成途徑下，研究了不同代謝中間產(chǎn)物如番茄紅素、胡蘿卜素、檸檬酸鈉、谷氨酸鈉、乙醇等物質(zhì)對于紅法夫酵母生長、類胡蘿卜素和蝦青素合成的影響，它們在一定濃度下對紅法夫酵母的生長、類胡蘿卜素和蝦青素合成都有促進作用。研究了真菌、化學(xué)誘導(dǎo)子對紅法夫酵母生長、類胡蘿卜素和蝦青素合成的影響，將由Rhodotorula rubra 、Rhodotorula glutinis 、Pa

7、nus conchatus 、Coriolus versicolor 、Mucor mucedo 和Mortieralla alpina 制備的真菌誘導(dǎo)子和用氯化鎘、二氧化鈦制備的化學(xué)誘導(dǎo)子以不同的濃度添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中，結(jié)果表明一定濃度下真菌誘導(dǎo)子對紅法夫酵母的生長、類胡蘿卜素和蝦青素合成有促進作用，在較高添加濃度下生物量、類胡蘿卜素產(chǎn)量和蝦青素產(chǎn)量比對照高，而在較低濃度下類胡蘿卜素和蝦青素含量比對照高?；瘜W(xué)誘導(dǎo)子對生長有一定的抑制作

8、用，而類胡蘿卜素和蝦青素產(chǎn)量相對對照有較大提高。在添加P. conchatus 、C. Versicolor 、氯化鎘和二氧化鈦誘導(dǎo)子后，誘導(dǎo)產(chǎn)生的紅法夫酵母胞內(nèi)活性氧含量隨時間而升高，在誘導(dǎo)后24~40 h 時胞內(nèi)活性氧含量最高，如二氧化鈦和氯化鎘在誘導(dǎo)后第40 h 胞內(nèi)活性氧均達到最高值，分別為299 和286 nmol g -1 FCW(fresh cell weight ，濕菌體重量)，證明胞內(nèi)活性氧對于蝦青素合成的確有促進作用