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文檔簡介
1、成骨細(xì)胞是蛋雞髓質(zhì)骨形成的主要功能細(xì)胞,其功能受鈣離子的調(diào)節(jié)。Transient receptor potential vanilloid6(TRPV6)是鈣離子跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運的限速“門控”通道。目前有關(guān)TRPV6對成骨細(xì)胞影響的報道主要集中在鼠及人類方面,對禽類國內(nèi)、外很少報道。因此,本試驗通過將沉默TRPV6基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至雞成骨細(xì)胞,檢測TRPV6對成骨細(xì)胞增殖、分化及凋亡的影響,旨在為探索蛋雞髓質(zhì)骨形成提供理論基礎(chǔ)。
兩次
2、酶消化法培養(yǎng)雞成骨細(xì)胞,并用堿性磷酸酶染色及鈣化結(jié)節(jié)染色法鑒定培養(yǎng)的細(xì)胞。取16日齡雞胚顱骨,0.1%胰酶消化15min后,剪碎,再用0.1%Ⅱ型膠原酶消化1h,獲取雞胚額骨成骨細(xì)胞群并鑒定。采用NBT/BCIP堿性磷酸酶染色試劑盒法對堿性磷酸酶進行染色,茜素紅法鑒定鈣化結(jié)節(jié)。選取生長狀態(tài)良好的成骨細(xì)胞,接種于96孔板,培養(yǎng)24 h,同時將成骨細(xì)胞分為3個試驗組,分別為用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染沉默TRPV6基因質(zhì)粒組(TRPV6-shRNA質(zhì)粒,
3、轉(zhuǎn)染試劑,成骨細(xì)胞)、轉(zhuǎn)染未沉默TRPV6基因質(zhì)粒組(negative-shRNA質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染試劑,成骨細(xì)胞)及未轉(zhuǎn)染組(轉(zhuǎn)染試劑,成骨細(xì)胞),每組8個重復(fù)。轉(zhuǎn)染后熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果。轉(zhuǎn)染成功后,分別培養(yǎng)24 h、48 h及72 h。在每一個時間點,用MTT法檢測細(xì)胞增殖率,PNPP偶氮法檢測堿性磷酸酶(ALP)活性。選取生長狀態(tài)良好的成骨細(xì)胞,接種于6孔板,細(xì)胞分組同MTT法,培養(yǎng)48 h時,分別通過熒光定量PCR、Western
4、 blot技術(shù)檢測雞成骨細(xì)胞TRPV6、ALP及凋亡相關(guān)基因的mRNA及蛋白表達。培養(yǎng)72h時用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。
結(jié)果表明,經(jīng)酶消化法培養(yǎng)的細(xì)胞具有明顯的成骨細(xì)胞樣特點,相差倒置顯微鏡觀察可見細(xì)胞貼壁生長,呈三角形、星形,80%~90%的細(xì)胞堿性磷酸酶染色呈陽性。隨著培養(yǎng)時間的延長,細(xì)胞重疊生長,連續(xù)培養(yǎng)13 d后出現(xiàn)鈣化結(jié)節(jié),茜素紅法染色呈強陽性,顯示細(xì)胞間出現(xiàn)致密、圓形紅色結(jié)節(jié)。因此,兩次酶消化法可獲得純度較高的
5、成骨細(xì)胞,可用于后續(xù)試驗研究。轉(zhuǎn)染TRPV6-shRNA質(zhì)粒組能在mRNA和蛋白水平上顯著抑制TRPV6表達(P<0.05),表明TRPV6-shRNA質(zhì)粒沉默效果顯著。轉(zhuǎn)染TRPV6-shRNA質(zhì)粒組的細(xì)胞數(shù)量與其他組相比顯著降低(P<0.05),24 h時,轉(zhuǎn)染TRPV6-shRNA質(zhì)粒組與未轉(zhuǎn)染組相比,差異極顯著(P<0.01)。轉(zhuǎn)染TRPV6-shRNA質(zhì)粒組的ALP活性與其他組相比24 h時極顯著降低(P<0.01),但48
6、h時為顯著(P<0.05)。轉(zhuǎn)染TRPV6-shRNA質(zhì)粒組的ALP mRNA和蛋白表達量顯著降低(P<0.05)。提示,沉默TRPV6后成骨細(xì)胞的增殖和分化能力均受到抑制。然而,轉(zhuǎn)染TRPV6-shRNA質(zhì)粒組的細(xì)胞凋亡率則顯著升高(P<0.05),與未轉(zhuǎn)染組比較差異極顯著(P<0.01);細(xì)胞凋亡相關(guān)基因(Caspases-3,Caspases-7 and Caspases-9)的mRNA表達量均呈升高趨勢,尤其Caspases-3
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