急性大量灌酒后大鼠腦組織iNOS、ET-1表達(dá)變化的研究.pdf

1、目的：隨著國(guó)民經(jīng)濟(jì)的不斷發(fā)展和人民生活水平的快速提高，各種酒精類飲料在生活大量出現(xiàn)。飲酒已成為一種重要的公關(guān)或社交手段，除了損害身體外，還導(dǎo)致了更多的精神、心理及各種糾紛或法律案件等社會(huì)問(wèn)題，已成為世界各國(guó)普遍關(guān)注的焦點(diǎn)。研究表明大量飲酒可直接損傷和/或通過(guò)產(chǎn)生的細(xì)胞因子間接調(diào)節(jié)血管的舒縮狀態(tài)，改變血腦屏障的通透性，影響凝血功能及細(xì)胞膜的穩(wěn)定性和通透性，促進(jìn)了腦血管意外的發(fā)生。在法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中，飲酒后輕微外力或無(wú)外力作用下蛛網(wǎng)膜下腔出血的

2、案件時(shí)有發(fā)生。在此類案件中，體內(nèi)酒精的作用機(jī)制及其參與度已成為法醫(yī)學(xué)重要的研究方向之一，也是此類案件鑒定的關(guān)鍵。
　　 研究表明長(zhǎng)期飲酒者體內(nèi)產(chǎn)生過(guò)多的自由基(Free radicals，F(xiàn)Rs)，損傷細(xì)胞膜，破壞蛋白質(zhì)、酶和核酸等細(xì)胞成分，并導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)、外酶類、各種調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)異常，參與了疾病和損傷的發(fā)生、發(fā)展。酒精還可通過(guò)還原型輔酶Ⅱ(NADPH)誘導(dǎo)損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)NO、ET-1和前列環(huán)素(PGI2)等多種物質(zhì)的釋放

3、，從而使血管本身的舒縮功能和狀態(tài)發(fā)生改變。NO與ET-1是體內(nèi)一對(duì)具有調(diào)控血管舒縮功能的重要物質(zhì)，分布廣泛，從中樞神經(jīng)細(xì)胞到外周血管都有分布，而且影響其分泌的因素也眾多。當(dāng)兩者分泌失衡時(shí)就可能造成血管擴(kuò)張或收縮異常，導(dǎo)致血管意外的發(fā)生。介于NO半衰期很短，在血液中不易及時(shí)、準(zhǔn)確檢測(cè)，可通過(guò)檢測(cè)能催化產(chǎn)生NO的誘導(dǎo)性一氧化氮合酶(iNOS)反應(yīng)NO的表達(dá)水平。
　　 本實(shí)驗(yàn)擬以急性大量灌酒大鼠模型為研究對(duì)象，通過(guò)對(duì)大鼠行為學(xué)、體重

4、和腦組織病理學(xué)變化進(jìn)行觀察，并進(jìn)一步應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法研究大鼠腦組織中iNOS和ET-1的表達(dá)變化，為酒精參與蛛網(wǎng)膜下腔出血的作用機(jī)制及其參與度提供理論基礎(chǔ)，也為法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中此類案件的鑒定提供理論依據(jù)。
　　 方法：健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠50只，體重220g士10g，隨機(jī)分為對(duì)照組(n=10)、飲酒各組。飲酒各組根據(jù)灌酒時(shí)間不同分為7d組、14d組、21d組、28d組(n=10)。用市售56％v/v北

5、京紅星二鍋頭白酒制備急性大量灌酒大鼠模型，采用灌胃器灌胃，每天2次，間隔10小時(shí)。實(shí)驗(yàn)前各組均給予適應(yīng)性蒸餾水灌胃1周。飲酒各組每次按1.2mL/100g劑量灌注。對(duì)照組用等體積蒸餾水代替白酒進(jìn)行灌胃。實(shí)驗(yàn)期間觀察大鼠行為學(xué)和體重變化。飲酒各組分別于末次灌胃后2小時(shí)迅速麻醉斷頭處死。取腦后分別在視交叉后2mm處和大小腦分界處將腦組織分為三部分制作石蠟切片，進(jìn)行HE染色觀察大鼠腦組織病理學(xué)改變；進(jìn)一步應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法觀察大鼠腦組織iN

6、OS、ET-1的表達(dá)變化。
　　 采用Media Cybemetics公司IPP圖像分析軟件，對(duì)iNOS、ET-1表達(dá)水平進(jìn)行積分光密度測(cè)定，結(jié)果以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(Mean士SD)表示，用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組均數(shù)的比較行單因素方差分析(ANOVA)，用最小顯著差法(LSD)作兩兩比較，以p＜0.05為有顯著性差異。
　　 結(jié)果：
　　 1行為學(xué)改變及體重變化
　　 1.1行為學(xué)改

7、變
　　 對(duì)照組灌胃后活動(dòng)、進(jìn)食無(wú)明顯變化；飲酒各組大鼠隨灌胃時(shí)間的延長(zhǎng)，可出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)系統(tǒng)異常表現(xiàn)：興奮性增加，動(dòng)作活躍，平衡性差，反應(yīng)性差，嗜睡甚至癱軟。
　　 對(duì)照組大鼠一般狀況良好，毛色光滑，行動(dòng)自如、靈活，進(jìn)食與以前變化無(wú)差異，排便干燥、球狀；隨著實(shí)驗(yàn)的延長(zhǎng)，飲酒各組大鼠皮毛暗淡無(wú)光，外形雜亂，活動(dòng)性差，反應(yīng)性不靈敏，進(jìn)食量減少，大便稀疏。
　　 1.2體重變化
　　 對(duì)照組大鼠體重逐漸增

8、加；隨著時(shí)間延長(zhǎng)，飲酒各組大鼠體重增長(zhǎng)緩慢，28d組體重與對(duì)照組相比有顯著性差異(p＜0.05)。
　　 2 組織病理學(xué)改變
　　 2.1腦組織HE染色
　　 對(duì)照組：腦組織結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞排列整齊，形態(tài)規(guī)則。飲酒各組：隨著灌酒時(shí)間的延長(zhǎng)，大腦皮層神經(jīng)元水腫，排列紊亂，細(xì)胞周圍間隙增大，細(xì)胞核固縮濃染，蛛網(wǎng)膜下腔血管淤血，28d組可見嗜神經(jīng)元現(xiàn)象。
　　 2.2iNOS免疫組織化學(xué)結(jié)果
　　 對(duì)照組

9、：腦組織內(nèi)少數(shù)神經(jīng)細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞iNOS呈陽(yáng)性表達(dá)，腦動(dòng)脈和實(shí)質(zhì)內(nèi)微小血管未見iNOS陽(yáng)性表達(dá)。飲酒各組：21d組和28d組腦組織內(nèi)膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞iNOS陽(yáng)性表達(dá)增強(qiáng)，與對(duì)照組比較有明顯差異（21d組p＜0.01，28d組p＜0.05）；在腦動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞及腦實(shí)質(zhì)微小血管內(nèi)皮細(xì)胞中，21d組、28d組可見iNOS明顯陽(yáng)性表達(dá)。
　　 2.3ET-1免疫組織化學(xué)結(jié)果
　　 對(duì)照組：腦組織內(nèi)少數(shù)神經(jīng)細(xì)胞及膠質(zhì)細(xì)

10、胞ET-1呈陽(yáng)性表達(dá)。飲酒各組：14d組ET-1在神經(jīng)細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞中陽(yáng)性表達(dá)增強(qiáng)，與對(duì)照組有顯著差異(p＜0.01);21d組ET-1表達(dá)較14d組減少，但仍高于對(duì)照組，有差異(p＜0.05）；僅個(gè)別腦實(shí)質(zhì)小血管內(nèi)皮細(xì)胞有小量ET-1陽(yáng)性表達(dá)。
　　 結(jié)論：
　　 1 急性大量灌酒后大鼠腦組織iNOS、ET-1呈陽(yáng)性表達(dá)，并隨灌酒時(shí)間延長(zhǎng)呈動(dòng)態(tài)變化。
　　 2 上述改變可能是急性大量飲酒引起腦血管功能紊亂并導(dǎo)