白芍總苷對(duì)系統(tǒng)性紅斑狼瘡樣小鼠的治療作用及對(duì)TH17-Treg細(xì)胞免疫失衡的影響.pdf

1、目的和意義: 系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是一種可以引起全身多個(gè)系統(tǒng)損害的慢性非器官特異性自身免疫性疾病，其血清中含有以抗核抗體為主的大量不同的自身抗體。SLE早期臨床表現(xiàn)多種多樣，初發(fā)時(shí)可僅累及單個(gè)器官，如皮膚、腎臟、關(guān)節(jié)等，也可多個(gè)器官同時(shí)受累。關(guān)節(jié)及皮膚表現(xiàn)為本病最常見的早期癥狀，其次是發(fā)熱、光敏感、雷諾現(xiàn)象、腎炎及漿膜炎等。SLE廣泛分布于世界各地，全世界的患病率約為17～48/10萬，中國大陸的調(diào)查顯示SLE的患病率為40～70/

2、10萬[1]。SLE好發(fā)于青年女性，多見于15～45歲，男女之比1∶7～9。SLE的發(fā)病原因尚不清楚，目前發(fā)現(xiàn)與本病有關(guān)的因素主要包括遺傳、病毒感染、環(huán)境、藥物等有關(guān)。本病的發(fā)病機(jī)理迄今尚未完全闡明，但大量研究研究證明SLE是一種自身免疫性疾病，遺傳、環(huán)境、病毒等多因素的相互作用致使機(jī)體自身組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，免疫活性細(xì)胞數(shù)量及功能異常，從而引起免疫平衡的紊亂，使機(jī)體對(duì)自身組織產(chǎn)生異常免疫反應(yīng)（包括體液免疫和細(xì)胞免疫），正常組織被自身

3、免疫細(xì)胞或自身抗體破壞而發(fā)病。
　　 SLE產(chǎn)生的自身抗體多種多樣，但主要是B細(xì)胞對(duì)核酸及其結(jié)合相關(guān)蛋白的應(yīng)答而產(chǎn)生的IgG型自身抗體，這類抗體的產(chǎn)生需要Th細(xì)胞協(xié)助。近年大量研究發(fā)現(xiàn)CD4+T細(xì)胞根據(jù)發(fā)育、功能及分泌細(xì)胞因子的作用不同，分成Th1細(xì)胞、Th2細(xì)胞、Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞四個(gè)亞群。Th1和Th2細(xì)胞為兩類重要的介導(dǎo)免疫反應(yīng)的效應(yīng)性T細(xì)胞，二者相互調(diào)控，維持機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)。來自國內(nèi)外不同動(dòng)物模型及人類SLE的研究

4、顯示，SLE患者Th1/Th2偏離方向至今尚未定論。目前關(guān)于SLE體內(nèi)Th1/Th2誰占優(yōu)勢(shì)尚無統(tǒng)一定論，Th1優(yōu)勢(shì)假說認(rèn)為Th1細(xì)胞與病情活動(dòng)初期及加重有關(guān);以Th1型免疫紊亂占主導(dǎo)的SLE患者多表現(xiàn)為嚴(yán)重的機(jī)體組織損害。Th2優(yōu)勢(shì)假說認(rèn)為Th2細(xì)胞及其產(chǎn)生的細(xì)胞因子輔助B淋巴細(xì)胞活躍產(chǎn)生大量自身抗體，從而導(dǎo)致SLE的發(fā)病。目前多認(rèn)為SLE患者體內(nèi)存在Th2優(yōu)勢(shì)，但也有實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)Th1優(yōu)勢(shì)的存在。
　　 Th17細(xì)胞以分泌I

5、L-17(IL-17A)而得名，除此之外，還分泌IL-17F、IL-21、IL-22及TNFα，能夠誘導(dǎo)局部細(xì)胞分泌吸引中性粒細(xì)胞的細(xì)胞因子和趨化因子，從而在介導(dǎo)慢性炎癥、防御胞外細(xì)菌感染及自身免疫性疾病等過程中發(fā)揮重要作用。
　　 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)是近年在人和小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的具有免疫抑制作用的CD4+T細(xì)胞亞群，其可通過不同途徑作用于多種靶細(xì)胞，對(duì)機(jī)體免疫應(yīng)答進(jìn)行精細(xì)的負(fù)向調(diào)節(jié)，從而穩(wěn)定機(jī)體免疫平衡、維持機(jī)體免疫耐受。根

6、據(jù)其產(chǎn)生的細(xì)胞因子、表面標(biāo)記的不同，Treg細(xì)胞可分為CD4+CD25+Treg細(xì)胞、Tr1和Th3等多種亞型。CD4+CD25+Treg細(xì)胞被認(rèn)為是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞家族中最主要的一群，叉頭狀家族轉(zhuǎn)錄因子(FoxP3)是其特異的標(biāo)記，在調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的發(fā)育和發(fā)揮功能過程中起到關(guān)鍵作用。許多研究證實(shí)FoxP3表達(dá)的增加可以誘導(dǎo)CD4+CD25-T細(xì)胞向CD4+CD25+Treg細(xì)胞分化[2]。介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的Th17細(xì)胞與介導(dǎo)免疫耐受的Treg細(xì)

7、胞都來源于初始T細(xì)胞，兩者的分化和功能相互抑制，在正常情況下兩者保持平衡，以維持機(jī)體免疫穩(wěn)定狀態(tài)，是對(duì)Th1/Th2免疫平衡理論的重要補(bǔ)充。二者失衡則可能導(dǎo)致多種自身免疫性疾病的發(fā)生。我們推測(cè)Th17細(xì)胞/Treg細(xì)胞數(shù)量和功能的失衡可能參與了SLE的發(fā)病及病情的發(fā)展。
　　 SLE患者大多需要長期使用糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑，但其諸多毒副作用易造成患者的再次傷害，患者依從性較差。且糖皮質(zhì)激素的使用遵循嚴(yán)格的禁忌癥，如活動(dòng)性消化道

8、潰瘍、嚴(yán)重高血壓、精神病、糖尿病、骨質(zhì)疏松、青光眼及抗菌藥不能控制的感染等，同樣限制了其臨床應(yīng)用。白芍總苷(TGP)是近年從傳統(tǒng)中藥白芍(Pall)根中提取的有效成分，主要含有芍藥苷(PF)、芍藥內(nèi)酯苷(Alb)、羥基芍藥苷、芍藥花苷、苯甲酰芍藥苷等成分，其中芍藥苷含量占總苷的90％以上，一般認(rèn)為是白芍總苷的主要有效成分。現(xiàn)代藥理研究表明，TGP具有多途徑調(diào)節(jié)自身免疫反應(yīng)，能夠抑制單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生和分泌炎性細(xì)胞因子，清除氧自由基、影響細(xì)

9、胞增殖以及抗炎、止痛、抗應(yīng)激、保肝等作用，近年來在臨床上已廣泛應(yīng)用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、SLE等風(fēng)濕免疫性疾病，不良反應(yīng)輕微且可以耐受。經(jīng)查閱文獻(xiàn)，尚未見關(guān)于TGP對(duì)SLE背景下Th17/Treg數(shù)量影響的報(bào)道。
　　 流式細(xì)胞術(shù)(FCM)是七十年代發(fā)展起來的高新科學(xué)技術(shù)，它集計(jì)算機(jī)技術(shù)、激光技術(shù)、流體力學(xué)、細(xì)胞化學(xué)、細(xì)胞免疫學(xué)于一體，同時(shí)具有分析和分選細(xì)胞功能。它不僅可測(cè)量細(xì)胞大小、內(nèi)部顆粒的性狀，還可檢測(cè)細(xì)胞表而和細(xì)胞漿抗原、細(xì)

10、胞內(nèi)DNA、RNA含量等，可對(duì)群體細(xì)胞在單細(xì)胞水平上進(jìn)行分析，在短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)分析大量細(xì)胞，并收集、儲(chǔ)存和處理數(shù)據(jù)，進(jìn)行多參數(shù)定量分析;能夠分類收集并分選某一亞群細(xì)胞，分選純度＞95％。在血液學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、藥物學(xué)、分子生物學(xué)等學(xué)科廣泛應(yīng)用。本課題利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)TGP對(duì)狼瘡鼠外周淋巴組織中Th17/Treg細(xì)胞數(shù)量的影響。
　　 本研究擬采用品系為MRL/1pr的狼瘡樣小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，研究有效劑量內(nèi)不同濃度白芍總苷隨用藥時(shí)

11、間延長對(duì)狼瘡樣小鼠尿蛋白含量及抗ds-DNA的影響，利用流式細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)觀察白芍總苷對(duì)狼瘡樣小鼠脾淋巴細(xì)胞中CD4+IL-17+T細(xì)胞（Th17細(xì)胞）及CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞（Treg細(xì)胞）數(shù)量的影響，初步探討白芍總苷對(duì)狼瘡鼠的治療作用及對(duì)外周淋巴組織Th17/Treg細(xì)胞數(shù)量的調(diào)控作用及免疫機(jī)制，進(jìn)一步完善SLE外周Th17/Treg細(xì)胞失衡機(jī)制的學(xué)說，填補(bǔ)國內(nèi)外研究關(guān)于白芍總苷對(duì)SLE背景下Th17/Treg細(xì)胞平衡的

12、調(diào)控作用理論的空白。
　　 研究方法:
　　 1、采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)IgG型抗ds-DNA抗體濃度。
　　 2、采用考馬斯亮藍(lán)法檢測(cè)小鼠尿蛋白含量。
　　 3、采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同處理組狼瘡小鼠脾臟淋巴細(xì)胞中CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞、CD4+IL-17+T細(xì)胞分別占CD4+T細(xì)胞的百分率，計(jì)算CD4+IL-17+T細(xì)胞/CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞比例。并分析小鼠尿

13、蛋白分別與Th17/CD4+T細(xì)胞、Treg/CD4+T細(xì)胞及Th17/Treg細(xì)胞的相關(guān)性。
　　 研究內(nèi)容和過程1.實(shí)驗(yàn)分組:20只MRL/1pr小鼠購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，雌性，3月齡，檢疫合格，并且在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，該批小鼠一直飼養(yǎng)于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室內(nèi)。檢測(cè)出小鼠血清抗ds-DNA抗體及尿蛋白陽性時(shí)確立狼瘡發(fā)病模型。采用隨機(jī)數(shù)字表法分為TGP高濃度組（7只）、TGP低濃度組（7只）和對(duì)照組（6

14、只）。根據(jù)《人與動(dòng)物間體表面積折算的等效劑量比值表》[3]折算，TGP高濃度組按給予121mg/kg的TGP懸液灌胃，TGP低濃度組給予81mg/kg的TGP懸液灌胃，對(duì)照組給予同等體積（0.2ml/10g體重）純凈水灌胃，均每天1次，連續(xù)4周。
　　 2.研究方法
　　 (1)每日定時(shí)觀察各組小鼠毛發(fā)、行為活動(dòng)、精神狀態(tài)、攝食、活動(dòng)等一般情況并每日記錄。
　　 (2)分別于用藥后第0周、第2周末清晨固定時(shí)間經(jīng)眼

15、眶后靜脈叢采血0.2～0.3ml，第4周末心臟采血0.2～0.3ml，離心，取血清，-80℃冰箱中保存，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)集中檢測(cè)IgG型抗ds-DNA抗體濃度;同時(shí)利用代謝籠收集24小時(shí)尿液置于-80℃冰箱中保存，考馬斯亮藍(lán)法集中檢測(cè)尿蛋白含量。
　　 (3)于用藥4周后集中處死小鼠，解剖取出脾臟，制備脾臟單細(xì)胞懸液行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脾臟CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞、CD4+IL-17+T細(xì)胞分別占CD4+T細(xì)

16、胞的百分率，計(jì)算出CD4+CD25+Foxp3+T/CD4+IL-17+T細(xì)胞比例。并分析小鼠尿蛋白分別與Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞及二者比例的相關(guān)性。
　　 3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 (1)所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理分析:各計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((X)±S)表示。
　　 (2)三個(gè)時(shí)段各組尿蛋白及抗ds-DNA抗體濃度的比較用采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析。各個(gè)時(shí)段內(nèi)不同處理組之間數(shù)據(jù)的比較采用單向方

17、差分析。滿足方差齊性時(shí)，各組均數(shù)間的多重比較用LSD方法分析;不滿足方差齊性時(shí)，使用Welch方法分析，各組間均數(shù)間的多重比較使用校正的多重比較方法(Dunnett's T3)方法進(jìn)行分析。
　　 (3) CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞、CD4+IL-17+T細(xì)胞分別占CD4+T細(xì)胞的百分率、及CD4+IL-17+T細(xì)胞/CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞比例的比較使用單向方差分析。方差齊性分析同上。
　　 (4

18、)分析尿蛋白分別與CD4+CD25+Foxp3+T/CD4+T細(xì)胞、CD4+IL-17+T/CD4+T細(xì)胞的百分率及CD4+IL-17+T/CD)4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞的相關(guān)性時(shí)，采用雙變量相關(guān)性分析，各組數(shù)據(jù)均服從正態(tài)分布時(shí)采用Pearson相關(guān)分析，不服從正態(tài)分布時(shí)則用Spearman相關(guān)分析。
　　 (5)以P＜0.05視為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1、一般狀況:用藥前三組小鼠的攝

19、食活動(dòng)正常，自主活動(dòng)靈敏自如，毛發(fā)光澤。隨著時(shí)間的推移，對(duì)照組小鼠逐漸出現(xiàn)精神倦怠、喜蜷臥，攝食次數(shù)較前減少，活動(dòng)次數(shù)減少，活動(dòng)靈敏度下降，毛發(fā)光澤度下降，其中4只小鼠頸背部毛發(fā)脫落明顯。TGP低濃度組與高濃度組攝食活動(dòng)及活動(dòng)次數(shù)、靈敏度較發(fā)病前無明顯改變，無明顯毛發(fā)脫落，僅毛發(fā)光澤度較前有所下降。實(shí)驗(yàn)過程中各組小鼠眼、耳、鼻、口均未見異常分泌物;大便無稀爛，尿量未見異常，尿液肉眼透明;全部小鼠均無死亡。
　　 2、抗ds-DN

20、A抗體濃度變化:用藥前及用藥2周后，三組小鼠的抗ds-DNA抗體濃度無顯著差異(P＞0.05);用藥四周后，TGP處理組抗ds-DNA抗體水平均顯著高于對(duì)照組(P=0.000，P=0.000)。
　　 TGP高濃度組抗ds-DNA抗體濃度隨時(shí)間推移呈逐漸上升趨勢(shì)，第4周末顯著高于0周和2周末(P=0.002，P=0.005)，第0周與第2周無顯著性差異(P=0.835);TGP低濃度組抗ds-DNA抗體濃度在第4周末顯著高于0周

21、和2周末(P=0.019，P=0.000)，第0周與第2周無顯著性差異(P=0.933);對(duì)照組抗ds-DNA抗體水平在三個(gè)時(shí)間段內(nèi)呈逐漸上升的趨勢(shì)，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.460, P=0.257, P=0.122)。
　　 3、尿蛋白濃度變化:用藥前及用藥2周后，三組小鼠的尿蛋白濃度無顯著差異(P＞0.05);用藥4周后，TGP高濃度組顯著低于TGP低濃度組(P=0.005)，TGP高濃度組及低濃度組均顯著低于對(duì)照組(

22、P=0.014、P=0.04)。
　　 TGP高濃度組用藥4周后分別與用藥2周后、用藥前比較，其尿蛋白變化均有顯著差異(P=0.003，P=0.006)。TGP低濃度組尿蛋白呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)照組小鼠尿蛋白第4周末分別與第2周末及用藥前相比顯著升高(P=0.048，P=0.007)。
　　 4、脾臟CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的百分率:脾臟CD4+CD25+Foxp3+

23、T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的百分率隨著TGP濃度的增加呈逐漸遞增趨勢(shì)，其水平依次是:0.49±0.13％、0.53±0.04％、0.97±0.20％。其中，TGP高濃度組脾淋巴細(xì)胞中CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的百分率分別顯著高于TGP低濃度組(P=0.031)與純凈水對(duì)照組(P=0.025)，TGP低濃度組高于對(duì)照組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.84)。
　　 5、CD4+IL-17+T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞

24、的百分率:脾淋巴細(xì)胞中CD4+IL-17+T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的百分率隨著TGP濃度的增加呈逐漸遞減趨勢(shì)，其水平分別是:6.02±3.06％、4.63±1.21％、3.20±0.83％，但各組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(PH-L=0.598，PH-C=0.321，PL-C=0.607，P＞0.05)。
　　 6、脾淋巴細(xì)胞中脾淋巴細(xì)胞中CD4+IL-17+T/CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞比例:脾淋巴細(xì)胞中CD4+IL-17+T

25、/CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞比例隨著TGP濃度下降呈上升趨勢(shì)，其水平分別是:4.27±1.28、8.91±2.20、12.38±3.82。TGP高濃度組CD4+IL17+T/CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞比例顯著高于對(duì)照組(P=0.049)，TGP低濃度組低于純凈水對(duì)照組、高于TGP高濃度組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.357、P=0.224)。
　　 7、三組小鼠尿蛋白分別與 CD4+IL-17+T/CD4+T

26、細(xì)胞、CD4+CD25+Foxp3+T/CD4+T細(xì)胞及CD4+IL-17+T/CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞行相關(guān)性分析。
　　 CD4+CD25+Foxp3+T/CD4+T細(xì)胞百分率與小鼠尿蛋白濃度呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.481，P=0.032）;CD4+IL-17+T/CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞比值與尿蛋白濃度呈顯著正相關(guān)(r=0.609，P=0.006); CD4+IL-17+T/CD4+T細(xì)胞百分率與尿

27、蛋白無顯著相關(guān)性(r=0.301，P=0.198)。
　　 結(jié)論:
　　 1、TGP能夠改善MRL/1pr狼瘡樣小鼠的一般情況，如維持正常的精神狀態(tài)、攝食活動(dòng)、保持毛發(fā)光澤度、自主活動(dòng)靈敏度等，提示TGP對(duì)小鼠狼瘡樣病變狀態(tài)具有一定的改善，可以提高狼瘡樣小鼠的生存質(zhì)量。
　　 2、TGP能夠減少SLE模型小鼠尿蛋白含量，且在有效劑量內(nèi)隨著用藥劑量越大，用藥時(shí)間越長，其效果越顯著。
　　 3、TGP組狼瘡鼠

28、外周血抗ds-DNA抗體升高，同時(shí)其尿蛋白含量減少，提示TGP改善狼瘡腎臟損害，起到保護(hù)腎臟的作用在用藥早期可能并非通過減少抗ds-DNA抗體實(shí)現(xiàn)。抗ds-DNA抗體可能并非狼瘡腎的唯一致病因素。
　　 4、TGP能夠降低狼瘡鼠脾臟CD4+IL-17+T細(xì)胞水平，提高CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞水平，使Th17/Treg細(xì)胞比值降低，并呈藥物濃度依賴性，提示TGP能夠負(fù)向調(diào)節(jié)狼瘡小鼠Th17/Treg細(xì)胞平衡，進(jìn)而發(fā)揮抗

29、炎和免疫調(diào)節(jié)的作用。
　　 5、外周CD4+CD25+Foxp3+T的數(shù)量與小鼠尿蛋白濃度呈顯著負(fù)相關(guān)，提示CD4+CD25+Foxp3+T參與保護(hù)狼瘡腎臟損害。CD4+IL-17+T/CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞比值與狼瘡鼠尿蛋白濃度呈顯著正相關(guān)，提示SLE患者可能存在Th17/Treg細(xì)胞免疫失衡，且與腎臟損害有關(guān)。
　　 6、TGP具有調(diào)節(jié)SLE Th17/Treg免疫平衡的能力。其中TGP上調(diào)Treg細(xì)胞