SARS冠狀病毒spike蛋白受體結(jié)合域的表達(dá)及S1抗原表位多肽多克隆抗體制備.pdf

1、目的：
　　 利用大腸桿菌BL21原核表達(dá)系統(tǒng)對(duì)spike蛋白的受體結(jié)合域（RBD）片段進(jìn)行融合表達(dá)，為進(jìn)一步研究spike蛋白免疫原性及抗原特性提供了物質(zhì)基礎(chǔ)，同時(shí)建立HIS融合表達(dá)實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)；運(yùn)用Fmoc技術(shù)合成純化抗原多肽，免疫小鼠獲得多克隆抗體，為進(jìn)一步研究抗體特性并應(yīng)用于SARS疾病的預(yù)防、預(yù)后診斷及治療提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1、構(gòu)建PET32（a）-RBD重組質(zhì)粒進(jìn)行原核表達(dá)
　

2、　 依賴高效T4連接酶連接PET32（a）和RBD，轉(zhuǎn)化感受態(tài)BL21大腸桿菌。提取質(zhì)粒酶切電泳初步確定獲得PET32（a）-RBD重組質(zhì)粒，送TaKaRa公司測(cè)序。以IPTG誘導(dǎo)BL21大腸桿菌對(duì)融合蛋白進(jìn)行表達(dá)，運(yùn)用聚丙烯酰胺凝膠電泳及Western-blotting來(lái)檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物，保存菌種。
　　 2．SARS-CoV的S1蛋白抗原表位多肽合成及其抗體的制備
　　 以DNAstar軟件對(duì)S1蛋白R(shí)BD片段的原始序

3、列進(jìn)行軟件分析，選擇三段親水性強(qiáng)，抗原指數(shù)高的多肽，運(yùn)用Fmoc固相法合成三條肽鏈：CQ19（CFSNVYADSFVVK GDDVRQ）、TY-14（TRNIDATSTGNYNY）和LV-11(LRPFERDISNV)，分別與KLH和BSA偶聯(lián)成三條具有免疫原性多肽：KLH（BSA）-CQ19 KLH（BSA）-LV11 KLH（BSA）-TY14，免疫BABL/c小鼠剪尾取血檢測(cè)抗體產(chǎn)生情況（ELISA法）。小鼠在第一次免疫注射之前，

4、首先剪尾取血，該血清作為陰性對(duì)照加0.05％ NaN3-70℃保存。
　　 結(jié)果：
　　 1、PET32(a)-RBD重組質(zhì)粒構(gòu)建及其表達(dá)：
　　 （1）重組質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定：瓊脂糖凝膠電泳及測(cè)序表明重組質(zhì)粒PET32(a)-RBD構(gòu)建成功。
　　 （2）IPTG誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)：SDS-PAGE及Western-blotting實(shí)驗(yàn)表明融合蛋白在IPTG誘導(dǎo)下大量表達(dá)，未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的細(xì)菌對(duì)融合蛋白幾乎

5、不表達(dá)。（見(jiàn)圖1.3）。
　　 2、合成多肽制備抗體：
　　 （1）分析S蛋白：根據(jù)DNAstar軟件分析篩選S蛋白三段多肽：CQ19（378～396AA）、TY14(425～438AA)、LV11(448～458AA）具有較強(qiáng)抗原性和親水性。
　　 （2）多肽合成：氨基酸組分析表明合成正確序列CQ19、TY14、LV11多肽。
　　 （3）KLH-CQ19免疫小鼠獲得抗CQ19多克隆抗體：ELISA檢測(cè)

6、血清結(jié)果表明抗體產(chǎn)生為弱陽(yáng)性。1:103和1：104滴度OD值約等于陰性對(duì)照2倍。
　　 （4）KLH-LV11、KLH-TY14免疫小鼠均無(wú)抗體產(chǎn)生。
　　 結(jié)論：
　　 1、本研究構(gòu)建了PET32（a）-RBD重組質(zhì)粒，獲得融合蛋白在IPTG誘導(dǎo)下的穩(wěn)定表達(dá)，建立本實(shí)驗(yàn)室PET32（a）載體融合的平臺(tái)，為進(jìn)一步對(duì)SARS-CoVspike蛋白的研究奠定了基礎(chǔ)，但其純化效果及蛋白在純化后所具有的免疫特性還有待進(jìn)