乳腺癌中miR-21、miR-125b動(dòng)物成瘤實(shí)驗(yàn)及其靶基因表達(dá)與患者術(shù)后生存率關(guān)系的研究.pdf

1、目的：MicroRNAs是一類長(zhǎng)約20-24nt的單鏈非編碼RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)性調(diào)控靶基因的穩(wěn)定性和表達(dá)效率[1]。MicroRNAs的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[231，很可能是一類潛在的癌基因[4,5]或抑癌基因[6]。MiR-21被認(rèn)定為是一種癌基因，參與腫瘤發(fā)生的多個(gè)進(jìn)程[78,96,97,98,99]。近來(lái)的研究顯示miR-125b在多種腫瘤中充當(dāng)抑癌基因的功能[88,89,90,91]。但miR-21及miR-125b

2、對(duì)于乳腺癌細(xì)胞株動(dòng)物成瘤實(shí)驗(yàn)研究還未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)利用裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)證明它們?cè)谌橄侔┘?xì)胞中的功能。MircoRNAs能通過(guò)調(diào)控靶基因影響腫瘤的生長(zhǎng)[7]。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)已篩選出的miR-21及miR-125b靶基因進(jìn)行研究，HBP1、eIF4A2、RSK1、ETV6這四個(gè)靶基因表達(dá)水平與患者預(yù)后的關(guān)系尚未見(jiàn)報(bào)道。我們應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)miR-21及miR-125b預(yù)測(cè)靶基因的蛋白表達(dá)水平與乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系。另外，還應(yīng)有用細(xì)胞體外

3、實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)一步了解ETV6在乳腺癌中的功能。這些靶基因的研究為發(fā)現(xiàn)新的乳腺癌預(yù)后指標(biāo)及進(jìn)一步研究miRNA在乳腺癌發(fā)病機(jī)制中的作用打下基礎(chǔ)。
　　 方法：乳腺癌細(xì)胞株MCF-7分別轉(zhuǎn)染PNA-antimiR21及PNA-Control，MDA-MB-435細(xì)胞株分別轉(zhuǎn)染Pre-miRNA125b及Pre-Control，BALB/c雌性裸鼠皮下成瘤，觀察兩組間成瘤速度、腫瘤大小的差別。本實(shí)驗(yàn)組已經(jīng)應(yīng)用基因芯片和預(yù)測(cè)軟件得到miR

4、-21預(yù)測(cè)靶基因HBP1、eIF4A2、RAB6A、PACE4、PITX2及miR-125b預(yù)測(cè)靶基因ETS1、ETV6、RSK1、MNK2、UBE2E3、ASB13。搜集214例1999年至2004年中山大學(xué)腫瘤防治中心存檔的石蠟包埋浸潤(rùn)性乳腺癌組織，制作成組織芯片，所有病例都有完整的臨床病理資料及5年以上的隨訪資料，術(shù)前均未接受放化療，病理診斷均為浸潤(rùn)性乳腺癌。免疫組織化學(xué)EnVision二步法進(jìn)行蛋白表達(dá)染色。Kaplan-Mei

5、er方法和Cox回歸分析統(tǒng)計(jì)蛋白表達(dá)水平與乳腺癌預(yù)后的關(guān)系。ROC曲線看靶基因?qū)颊哳A(yù)后的預(yù)測(cè)效果。乳腺癌細(xì)胞株MCF-7、SK-BR-3分別轉(zhuǎn)染ETV6-siRNA和Control-siRNA后進(jìn)行ETV6蛋白Weston-blotting檢測(cè)了解其轉(zhuǎn)染效果，轉(zhuǎn)染后進(jìn)行細(xì)胞增殖、凋亡、克隆形成及細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)，了解ETV6在乳腺癌細(xì)胞中的功能。
　　 結(jié)果：裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)顯示Pre-miRNA125b及Pre-Control兩組間

6、腫瘤體積及瘤重有明顯差別(P＜0.05)，miR-125b具有明顯抑制MDA-MB-435細(xì)胞株皮下成瘤的能力；MCF-7組轉(zhuǎn)染PNA-antimiR-21后腫瘤體積、重量均比PNA-Control組的大，但統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)差異(P＞0.05)。Kaplan-Meier方法Log-Rank分析結(jié)果顯示miR-21預(yù)測(cè)靶基因HBP1、eIF4A2不同蛋白表達(dá)水平的術(shù)后5年生存率有顯著差別(P＜0.05)；miR-125b預(yù)測(cè)靶基因ETS1、ET

7、V6、RSK1不同蛋白表達(dá)水平的術(shù)后5年生存率有顯著差別(P＜0.05)。Cox多重回歸分析表明HBP1、 ETS1、ETV6及RSK1分別是乳腺癌獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)之一(P＜0.05)。ROC曲線結(jié)果提示相對(duì)與臨床常用的診斷指標(biāo)，HBP1、ETS1、ETV6、RSK1對(duì)乳腺癌患者的預(yù)測(cè)效果更好。Weston-blotting檢測(cè)ETV6-siRNA和Control-siRNA轉(zhuǎn)染MCF-7、SK-BR-3細(xì)胞株成功，后進(jìn)行增殖、凋亡、克隆形

8、成及細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)，證明ETV6有促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖和抑制凋亡的能力，但不是通過(guò)細(xì)胞周期調(diào)控其功能。
　　 結(jié)論：⑴裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)顯示miR-125b能夠抑制乳腺癌細(xì)胞皮下成瘤能力，說(shuō)明乳腺癌中miR-125b具有抑癌基因的功能。MiR-21在乳腺癌細(xì)胞裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)中的結(jié)果跟已有研究結(jié)果符合。⑵MiR-21預(yù)測(cè)靶基因的5年生存率的結(jié)果表明HBP1、eIF4A2可能作為乳腺癌預(yù)后的新指標(biāo)。⑶MiR-125b預(yù)測(cè)靶基因的5年生存率結(jié)果