雜色鮑抗副溶血弧菌血細(xì)胞ESTs分析及免疫功能基因的克隆.pdf

1、本文以本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)感染的雜色鮑(Haliotisdiversicolor)血細(xì)胞cDNA文庫(kù)為材料,對(duì)文庫(kù)進(jìn)行擴(kuò)增并經(jīng)隨機(jī)篩選后共測(cè)序4758條序列,經(jīng)生物信息學(xué)初步處理后得到高質(zhì)量的表達(dá)序列標(biāo)簽(Expressed Sequence Taqs,ESTs)4264條。拼接后獲得3638條唯一序列(unique sequences),其中重疊群(contigs)和單一序列(si

2、nglets)分別為484條和3154條;冗余率為14.68％。3638條唯一序列用Blast2go軟件進(jìn)行注釋。Blast注釋后,發(fā)現(xiàn)有398條(10.9％)EST在GenBank的非冗余蛋白庫(kù)找到了同源序列。GO注釋后發(fā)現(xiàn)這398個(gè)基因聚類(lèi)有340個(gè)可歸類(lèi)于細(xì)胞組分、生物學(xué)過(guò)程和分子功能。InterProScan注釋后,發(fā)現(xiàn)有950條序列可以找到同源序列,其中71條獲得了酶學(xué)編碼。將獲得了酶學(xué)編碼的71條序列在KEGG中的Pathw

3、ay數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行注釋,發(fā)現(xiàn)參與代謝途徑和氧化磷酸化的序列最多。我們對(duì)具有同源序列的基因進(jìn)行了人工功能分析,發(fā)現(xiàn)了35種(8.8％)與免疫相關(guān)的基因。結(jié)合EST序列分析、SMART RACE技術(shù)和基因組步移(Genome Walking)技術(shù)獲得雜色鮑(small abalone)半胱氨酸蛋白酶(cysteine protease,CP)、半胱氨酸蛋白酶抑制劑(cysteine proteases inhibitor或cystatin,CP

4、I)和脂多糖誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子a因子(LPS-induced TNF-a factor,LITAF)基因的全長(zhǎng)cDNA,分別命名為sacp、sacpi和salitaf,之后用head to toe PCR檢測(cè)cDNA序列開(kāi)放閱讀框的正確性,并采用實(shí)時(shí)定量PCR分析這些基因的組織表達(dá)及經(jīng)副溶血弧菌感染后的表達(dá)情況。結(jié)果如下:1)雜色鮑sacp cDNA全長(zhǎng)1558bp,開(kāi)放閱讀框編碼303個(gè)氨基酸,包含兩個(gè)CP活性位點(diǎn)。經(jīng)Blast同源性

5、分析,發(fā)現(xiàn)其為組織蛋白酶(cathepsin)L型。2)雜色鮑sacpi序列全長(zhǎng)1481bp,編碼253個(gè)氨基酸,包含一個(gè)CPI特征基序及Ⅱ型CPI激活位點(diǎn)的共有序列:Gly63,Q84VVSG88和P114W115。經(jīng)TFSEARCH在線預(yù)測(cè),雜色鮑sacpi的5'側(cè)翼序列存在HSF、BR-C Z3、NIT2、Oct-1、CdxA、MyoD、deltaEF1、ADR1、MATal、GATA-1、C/EBPbeta、SRY和Sox-5等

6、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。3)salitaf基因cDNA序列全長(zhǎng)為726bp,開(kāi)放閱讀框編碼78個(gè)氨基酸,包含兩個(gè)LITAF特征性的N-端、C-端Zn2+結(jié)合域。4)sacp基因在性腺、鰓、肝胰腺、外套膜、上足、肌肉和血細(xì)胞七個(gè)組織中均有表達(dá),在性腺、鰓和肝胰腺中,表達(dá)量最高。Sacpi基因主要在性腺和肝胰腺中表達(dá),在其他組織中不表達(dá)或表達(dá)量很低。Salitaf基因在七個(gè)組織中都有表達(dá),在鰓中的表達(dá)量最高,其次是上足和外套膜。5)弧菌感染后24

7、h,sacp基因在肝胰腺顯著上調(diào)表達(dá)(p＜0.05),感染48h后,表達(dá)量回降;sacpi基因在感染48h后,在肝胰腺顯著上調(diào)表達(dá)(p＜0.05),提示了sacpi對(duì)sacp的內(nèi)源性抑制;而satitaf基因感染48h后,在肝胰腺顯著上調(diào)表達(dá)(p＜0.05),96h后,顯著下調(diào)表達(dá)(p＜0.05)。6)感染弧菌后sacp基因在血細(xì)胞中的表達(dá),各個(gè)時(shí)相實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組都沒(méi)有顯著性差異(p＞0.05)。感染8h后,salitaf基因在血細(xì)胞中