加味小柴胡湯干預(yù)大鼠哮喘模型的實驗研究.pdf

1、目的：在建立支氣管哮喘大鼠模型的基礎(chǔ)上，給予加味小柴胡湯干預(yù)，通過動物實驗，從病理學(xué)、免疫組織化學(xué)和分子生物學(xué)等多角度探討中藥加味小柴胡湯治療支氣管哮喘大鼠模型作用機(jī)制，為臨床治療支氣管哮喘用藥提供實驗依據(jù)。
　　 方法：
　　 第一部分加味小柴胡湯對哮喘大鼠支氣管病理組織學(xué)觀察
　　 在適應(yīng)性飼養(yǎng)之后，將60只大鼠隨機(jī)分為6組，即正常組、模型組、中藥加味小柴胡湯高劑量組（簡稱高劑量組）、中藥加味小柴胡湯低劑量組

2、（簡稱低劑量組）、西藥地塞米松注射液組、中藥加味小柴胡湯加西藥地塞米松注射液組（簡稱中西藥組），每組10只。對各只大鼠分別標(biāo)記號碼，組間平均體重差控制在<20g，進(jìn)行藥物干預(yù)實驗。各治療組均從第1次哮喘激發(fā)開始（造模第3周）至處死前每天灌胃給藥，連續(xù)4周，正常組用生理鹽水灌胃，各組均每7天復(fù)查動物體重。
　　 參考相關(guān)文獻(xiàn)，將大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3天后，除正常組外，于實驗第1天和第8天各組大鼠腹腔內(nèi)注射10％卵蛋白、氫氧化鋁混合液1m

3、l，腰部兩側(cè)各取1點，每點皮下注射0.5ml，共計2 ml，使大鼠致敏。第15天起用3％卵蛋白40 ml噴霧激發(fā)大鼠哮喘發(fā)作，霧化流量控制在5ml/分鐘，每次15分鐘，隔日一次，共激發(fā)4周。以大鼠出現(xiàn)呼吸加快、口唇發(fā)紺、點頭呼吸及站立不穩(wěn)等表現(xiàn)為激發(fā)成功。正常對照組以生理鹽水代替卵蛋白進(jìn)行腹腔注射及霧化吸入。
　　 動物麻醉完全后，開胸迅速結(jié)扎右主支氣管，取右肺中葉4％多聚甲醛固定，脫水、包埋、切片，蘇木精-伊紅HE染色，鏡下觀

4、察病理學(xué)改變。
　　 造模之前測量一次大鼠體重；造模開始后每7天測一次大鼠體重，直至取材之前進(jìn)行最后一次測量；大鼠激發(fā)四周后計數(shù)1分鐘內(nèi)呼吸頻率和打噴嚏的次數(shù)。
　　 所有數(shù)據(jù)均用SPSS10.0統(tǒng)計分析軟件處理。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（（）±s）表示，組間采用單因素方差分析（Bonferroni）的方法進(jìn)行統(tǒng)計分析。顯著性差異水平以0.05和0.01為標(biāo)準(zhǔn)。
　　 第二部分加味小柴胡湯對支氣管哮喘大鼠血清中炎性

5、介質(zhì)NO（一氧化氮）和ET-1（內(nèi)皮素1）的影響
　　 動物分組、模型建立、用藥情況及數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理同前。在實驗的第42天，最后一次哮喘激發(fā)后稱重，并進(jìn)行大鼠腹主動脈取血，用于測定一氧化氮、內(nèi)皮素-1。采用硝酸還原酶法測定肺組織NO含量。由于NO化學(xué)性質(zhì)活潑，在體內(nèi)代謝很快轉(zhuǎn)為N02-和NO3-，而NO2-又進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為NO3-，本法利用硝酸還原酶特異性將NO3-還原為NO2-，通過顯色深淺測定其濃度的高低。采用放免法測定肺組織E

6、T-1含量。由自動γ-放射免疫計數(shù)器預(yù)先編制程序，直接給出標(biāo)準(zhǔn)曲線及樣品濃度。
　　 第三部分加味小柴胡湯對支氣管哮喘大鼠肺組織中細(xì)胞因子白介素（IL）-4和γ干擾素（IFN-γ）的調(diào)節(jié)作用
　　 動物分組、模型建立、用藥情況及數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理同前。動物麻醉完全后，開胸迅速結(jié)扎右主支氣管，取右肺上葉，稱重后移入玻璃勻漿管中，加入2倍肺組織重量的生理鹽水，充分研碎，使組織勻漿化。制備好的勻漿3500r/min，離心10 min

7、，提取上清液分裝，低溫冰箱保存待測。白介素（IL）-4和γ-干擾素（IFN-γ）測定采用酶聯(lián)免疫吸附方法（ELISA）。
　　 第四部分加味小柴胡湯對支氣管哮喘大鼠外周血及肺組織中EOS的影響
　　 動物分組、模型建立、用藥情況及數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理同前。動物麻醉完全后，開胸迅速結(jié)扎右主支氣管，取右肺中葉4％多聚甲醛固定，脫水、包埋、切片，蘇木精-伊紅HE染色，鏡下觀察肺組織中EOS浸潤改變。
　　 第五部分加味小柴胡湯

8、對支氣管哮喘大鼠肺組織中IL-5 mRNA表達(dá)的影響
　　 動物分組、模型建立、用藥情況及數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理同前。動物麻醉完全后，開胸迅速結(jié)扎右主支氣管，取近肺門處的右肺約100mg，放入Eppendorf管，加入1ml Trizol充分勻漿，投入液氮罐，待測RT-PCR。采用RT-PCR法檢測各組大鼠肺組織中IL-5 mRNA表達(dá)的變化。
　　 結(jié)論：
　　 1.采用皮下多點注射卵蛋白（OVA）的方法，成功誘導(dǎo)大鼠支

9、氣管哮喘模型。
　　 2.各治療組明顯改善大鼠的一般狀態(tài)，哮喘模型組肺組織支氣管及血管旁有大量的EOS浸潤，符合哮喘慢性炎癥過程中的病理改變。加味小柴胡湯高低劑量組均能減少腫組織EOS浸潤，尤其加味小柴胡湯高劑量組EOS減少更為明顯，作用優(yōu)于哮喘模型組和加味小柴胡湯低劑量組，可見加味小柴胡湯能有效抑制嗜酸性粒細(xì)胞浸潤，減輕氣道炎癥，降低氣道的高反應(yīng)性，為加味小柴胡湯有效治療哮喘提供了有利依據(jù)。
　　 3.加味小柴胡湯顯著

10、降低血中NO的表達(dá)。高、低劑量組加味小柴胡湯均能降低血中NO水平，但二者無顯著差異。加味小柴胡湯可以很好地降低血中ET-1水平，從而抑制哮喘炎癥的發(fā)展，防止或延緩氣道重塑。
　　 4.支氣管哮喘模型組大鼠肺組織IL-4含量較正常組顯著升高。，與模型組比較，各治療組均能降低肺組織IL-4含量，提高IFN-γ含量，說明加味小柴胡湯可通過降低肺組織IL-4含量，提高IFN-γ含量，從而調(diào)節(jié)免疫功能，減輕EOS對氣道浸潤，控制氣道炎癥。

11、
　　 5.加味小柴胡湯可明顯降低外支氣管哮喘大鼠外周血、肺支氣管中EOS的數(shù)量，可減輕哮喘動物模型的氣道炎性細(xì)胞的浸潤，同時可減輕哮喘動物模型的外周血炎性細(xì)胞的聚集。
　　 6.IL-5參與了支氣管哮喘的發(fā)病及氣道炎癥，加味小柴胡湯高劑量組、中藥加西藥組肺組織IL-5 mRNA的表達(dá)明顯降低，加味小柴胡湯可從轉(zhuǎn)錄水平降低肺組織IL-5mRNA的表達(dá)，促進(jìn)肺內(nèi)EOS凋亡，減少炎細(xì)胞浸潤，從而減輕了哮喘氣道炎癥，緩解哮喘氣