氨誘導(dǎo)的EGFR轉(zhuǎn)激活信號(hào)通路及其與星形膠質(zhì)細(xì)胞水腫的關(guān)系.pdf

1、急性肝衰竭時(shí)，腦內(nèi)氨濃度可升高至毫摩爾濃度水平。在腦內(nèi)，星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)肝衰竭及升高的氨濃度更為敏感。有研究稱慢性氨刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞增加哇巴因樣物質(zhì)的生成及Na，K-ATP酶的活性。Na，K-ATP酶由α及β亞單位組成，其中的α亞單位跨過細(xì)胞膜數(shù)次，具有Na+、K+、ATP及其特異性抑制劑哇巴因的結(jié)合位點(diǎn)。β亞單位為單次跨膜的糖蛋白，其大部分區(qū)域暴露于細(xì)胞外空間。α亞單位存在有四種亞型，即α1、α2、α3及α4。在成年腦及培養(yǎng)的中樞神經(jīng)系

2、統(tǒng)細(xì)胞，α1亞型在星形膠質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)元中均有表達(dá)，α2亞型主要在星形膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，而α3亞型只在神經(jīng)元中表達(dá)。鑒于哇巴因長時(shí)刺激上調(diào)培養(yǎng)的大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞α2亞型的事實(shí)，推測氨刺激增加星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)Na，K-ATP酶活性可能是其增加哇巴因樣物質(zhì)生成的結(jié)果。不知何故，大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物并不表達(dá)α2亞型。我們?cè)谥暗难芯恐邪l(fā)現(xiàn)，氨刺激可選擇性上調(diào)小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞α2亞型的基因表達(dá)，但對(duì)α1亞型的表達(dá)并無影響。
　　除了抑制Na，

3、K-ATP酶活性的活性，低濃度的哇巴因(0.1-1 nM)可以在不影響α1亞型泵活性的情況下，作為配體與α亞單位結(jié)合后，引起表皮生長因子受體的轉(zhuǎn)激活。經(jīng)典的EGF受體轉(zhuǎn)激活的過程為:在外界刺激如去極化、Gi/o或Gq蛋白偶聯(lián)受體激活或胞漿內(nèi)鈣濃度([Ca2+]i)增加時(shí)，引起由Zn2+依賴性金屬蛋白酶催化的EGFR配體的釋放，從而導(dǎo)致自身及鄰近細(xì)胞EGFR的轉(zhuǎn)激活，并接下來激活其下游的兩個(gè)主要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路:MAPK/ERK和PI3K

4、/AKT通路。而哇巴因與α1受體的結(jié)合后會(huì)招募Src，繼而Src磷酸化EGFR，啟動(dòng)其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。該過程發(fā)生于脂筏內(nèi)，并需要脂筏內(nèi)的主要成份小窩蛋白的參與。除了α1亞型，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)NaC1超載的高壓模型中，α2亞型也可作為哇巴因的受體。氨刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞α2亞型表達(dá)上調(diào)，該作用可被EGFR的阻斷劑AG1478及Src的阻斷劑PP1所抑制，而不受金屬蛋白酶抑制劑GM6001的影響，表明該過程中EGFR的磷酸化是Src直接刺激的結(jié)果，

5、而不涉及生長因子的水解釋放。
　　肝衰竭病人常伴有腦水腫，這是引起病人死亡的常見原因。而肝衰竭病人腦水腫主要是星形膠質(zhì)細(xì)胞水腫的結(jié)果。氨刺激培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞可以誘導(dǎo)其水腫。氨刺激引起星形膠質(zhì)細(xì)胞水腫的機(jī)制不明，最近的研究發(fā)現(xiàn)MAPK/ERK可能參與了該過程。
　　我們擬通過本實(shí)驗(yàn)探討①EGFR抑制劑AG1478、Src抑制劑PP1及金屬蛋白酶抑制劑GM6001對(duì)氨刺激引起的ERK磷酸化的影響;②氨刺激對(duì)EGFR磷酸化位點(diǎn)的

6、影響;③Na，K-ATP酶α1或α2亞型、Src及小窩蛋白-1在氨所致EGFR轉(zhuǎn)激活中的作用;④氨刺激對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞AKT信號(hào)通路的影響。⑤Src、小窩蛋白-1、EGFR及ERK在氨所致細(xì)胞水腫中的作用。
　　方法：
　　本研究以原代培養(yǎng)小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn):①以蛋白質(zhì)免疫印跡方法為手段，分別檢測EGFR抑制劑AG1478、Src抑制劑PP1及金屬蛋白酶抑制劑GM6001對(duì)氨刺激引起的ERK磷酸化的影響;

7、②利用蛋白質(zhì)免疫沉淀技術(shù)，檢測氨刺激對(duì)EGFR磷酸化位點(diǎn)的影響;③利用免疫共沉淀技術(shù)研究氨對(duì)EGFR、Na, K-ATP酶α1或α2亞型、Src、ERK、小窩蛋白-1間相互作用及Src與EGFR Tyr845位點(diǎn)間相互作用的影響;④利用RNA干擾技術(shù)探討小窩蛋白-1在氨致ERK活化中的作用;⑤利用RNA干擾技術(shù)探討小窩蛋白-1在氨致AKT活化中的作用;⑥利用蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)探討AKT信號(hào)通路對(duì)氨所致ERK活化的影響。⑦以Calcein

8、作為熒光指示劑，探討Src、小窩蛋白-1、EGFR及ERK在氨所致細(xì)胞水腫中的作用;使用SPSS12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多組資料用one-way ANOVA方法進(jìn)行比較，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1、氯化銨引起的星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)ERK1/2活化有EGFR及Src參與，但沒有金屬蛋白酶的參與
　　星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)3mM氯化銨20 min的刺激后，引起了較弱的，但有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的ERK磷酸化。

9、隨著刺激時(shí)間的延長，其磷酸化水平在1h后達(dá)到了對(duì)照水平的150％，2-4小時(shí)后則達(dá)到近200％。EGFR阻斷劑AG1478(1μM)及Src的阻斷劑PP1(10μM)完全抑制了氨對(duì)ERK的刺激作用，但金屬蛋白酶的抑制劑GM6001(10μM)并不影響氨對(duì)ERK的作用，表明EGFR及Src參與了氨所致的ERK磷酸化，而金屬蛋白酶并不參與該過程。
　　2、氯化銨刺激引起星形膠質(zhì)細(xì)胞EGFR磷酸化
　　星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)3mM氯化銨2

10、0分鐘的刺激后，其EGFR的兩個(gè)磷酸化位點(diǎn)Tyr45和Tyr1068的磷酸化水平明顯增加，而其Tyr92、Tyr1045及Tyr1173的磷酸化水平并未發(fā)生改變。
　　3、氯化銨刺激引起EGFR磷酸化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路
　　在利用小窩蛋白-1特異性抗體進(jìn)行的免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，3 mM氯化銨20分鐘的刺激能促進(jìn)EGFR、Na, K-ATP酶α1亞型、Src及ERK與小窩蛋白-1相互作用，而Na, K-ATP酶α2亞型并不參與該

11、過程。而且還發(fā)現(xiàn)，氨能刺激Src與EGFRTyr845位點(diǎn)的結(jié)合。利用小窩蛋白-1特異性siRNA處理星形膠質(zhì)細(xì)胞3天后，明顯抑制了3 mM氯化銨對(duì)ERK的刺激作用。
　　4、氨所致AKT活化沒有小窩蛋白-1的參與，但PI3K/AKT信號(hào)通路能影響ERK的活化
　　氨刺激明顯引起了星形膠質(zhì)細(xì)胞AKT的磷酸化，但小窩蛋白-1siRNA并未影響AKT的活化，表明其活化機(jī)制有別于ERK。但氨誘導(dǎo)的ERK磷酸化不但能夠被MEK/ER

12、K的抑制劑U0126及PD98059所抑制，還可以被PI3K/AKT信號(hào)通路的抑制劑LY294002及wortmannin所抑制，表明PI3K/AKT信號(hào)通路能夠影響氨對(duì)MEK/ERK的活化。
　　5、EGFR、Src、ERK及小窩蛋白-1參與了氨所致星形膠質(zhì)細(xì)胞水腫
　　星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)3mM氯化銨刺激12小時(shí)后發(fā)生了明顯的水腫，其體積約為對(duì)照水平的120-140％，氨對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞水腫的刺激作用可被EGFR抑制劑AG147

13、8、Src抑制劑PP1及MAPK抑制劑U0126所阻斷。不出所料，其也可以被小窩蛋白-1的特異性siRNA所抑制，但金屬蛋白酶抑制劑GM6001對(duì)氨所致星形膠質(zhì)細(xì)胞水腫并無影響。
　　討論：
　　腦水腫是急性肝性腦病中常見的嚴(yán)重并發(fā)癥，其往往引起患者的顱內(nèi)壓升高及腦疝。氨在肝性腦病的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用。肝衰竭中最易受到傷害的是星形膠質(zhì)細(xì)胞。在各種神經(jīng)病理中常?？梢砸姷叫切文z質(zhì)細(xì)胞的功能異常。高濃度氨刺激會(huì)誘發(fā)星形膠質(zhì)細(xì)胞

14、水腫。氨誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞水腫涉及多種機(jī)制，其中包括最近提出的MAPK/ERK信號(hào)通路。
　　目前對(duì)氨致MAPK/ERK信號(hào)通路活化的機(jī)制報(bào)道不多。我們之前的研究發(fā)現(xiàn)氨刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞α2亞型表達(dá)上調(diào)，該作用可被EGFR的阻斷劑AG1478及Src的阻斷劑PP1所抑制，而不受金屬蛋白酶抑制劑GM6001的影響，表明在氨的刺激下，星形膠質(zhì)細(xì)胞中有EGFR的轉(zhuǎn)激活，且該轉(zhuǎn)激活是Src直接刺激的結(jié)果，而不涉及生長因子的水解釋放。我們現(xiàn)在的

15、研究則發(fā)現(xiàn)，氨對(duì)MAPK/ERK信號(hào)通路的活化同樣涉及上述機(jī)制。而且，氨對(duì)MAPK/ERK信號(hào)通路的活化在時(shí)間上遠(yuǎn)早于其對(duì)α2亞型表達(dá)的上調(diào)(20 min vs1-4 d)?？梢姲睂?duì)Src-EGFR-MAPK/ERK的級(jí)聯(lián)活化是其引起星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷的一個(gè)重要的早期事件。
　　EGFR中包含有幾個(gè)參與其活化的酪氨酸磷酸化位點(diǎn)。為了進(jìn)一步證實(shí)氯化銨刺激對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的EGFR轉(zhuǎn)激活，我們利用免疫沉淀及免疫印跡技術(shù)對(duì)氯化銨刺激下EGF

16、R的5個(gè)磷酸化位點(diǎn)(Tyr845、Tyr992、Tyr1045、Tyr1068和Tyr1173)磷酸化水平的變化進(jìn)行了研究。我們發(fā)現(xiàn)雖然磷酸化位點(diǎn)Tyr992、Tyr1045及Tyr1173的磷酸化水平并未受氯化銨的影響，但氯化銨卻可以顯著增加EGFR在Tyr845及Tyr1068兩個(gè)位點(diǎn)上的磷酸化?？傊?，上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，高氨刺激能夠通過EGFR轉(zhuǎn)激活的方式激活星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)級(jí)聯(lián)，其中包括其下游的MAPK/ERK通路。
　

17、　有研究稱慢性氨刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞增加哇巴因樣物質(zhì)的生成及Na, K-ATP酶的活性。Na，K-ATP酶是位于細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)，其主要功能主要表現(xiàn)在兩方面。一方面，作為離子轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)以維持跨膜的Na+和K+梯度。另一方面，Na，K-ATP酶還可作為強(qiáng)心甾體類物質(zhì)的受體以介導(dǎo)哇巴因及其它的內(nèi)源性地洋地黃樣物質(zhì)對(duì)細(xì)胞的效應(yīng)。Na，K-ATP酶主要由具有催化活性的α亞單位及糖基化的β亞單位組成。而其中的α亞單位是傳遞哇巴因信號(hào)時(shí)起主要作用的多肽。

18、目前已有很多關(guān)于Na, K-ATP酶介導(dǎo)的信號(hào)的研究。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞中存在有兩大類群的Na，K-ATP酶，其中位于富含膽固醇的胞漿膜小窩中的Na, K-ATP酶與其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能有關(guān)。在小窩中，Na，K-ATP酶可以與其它蛋白組成復(fù)合物的形式實(shí)現(xiàn)其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能。在與哇巴因結(jié)合后，Na，K-ATP酶與鄰近的蛋白相互作用，繼而導(dǎo)致Src、EGFR及其下游MAPK/ERK通路的活化。該過程需要小窩中主要成分小窩蛋白-1的參與。
　　我們

19、推測氨誘導(dǎo)的EGFR轉(zhuǎn)激活可能與其增加星形膠中質(zhì)細(xì)胞內(nèi)哇巴因樣物質(zhì)的生成有關(guān)。為驗(yàn)證這個(gè)推論，我們?cè)诒緦?shí)驗(yàn)進(jìn)行了幾個(gè)重要的觀察。我們首先發(fā)現(xiàn)，氨刺激可以促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞中EGFR、Na，K-ATP酶α1、Src、ERK及小窩蛋白-1間相互作用，表明氨誘導(dǎo)的EGFR轉(zhuǎn)激活也需要通過各個(gè)分子在小窩中組成復(fù)合物，以促進(jìn)分子間的相互作用來實(shí)現(xiàn)。需要指出的是，雖然在中樞神經(jīng)系統(tǒng)NaCl超載的高壓模型中，α2亞型也可作為哇巴因的受體。但在我們的實(shí)驗(yàn)

20、中，Na, K-ATP酶α2亞型沒有參與氨刺激下各個(gè)信號(hào)分子間的相互作用，表明畦巴因在介導(dǎo)氨信號(hào)時(shí)是以Na，K-ATP酶α1為其受體的。的確，多數(shù)情況下Na,K-ATP酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能都是通過α1亞型實(shí)現(xiàn)的。
　　接著，在利用Src抗體進(jìn)行的免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，氨可以顯著增強(qiáng)Src與EGFR Tyr845位點(diǎn)間的相互作用。這樣看來，氨對(duì)EGFR Tyr845位點(diǎn)的磷酸化是Src激活的結(jié)果。的確，已經(jīng)證實(shí)Tyr845是一個(gè)Src

21、相關(guān)的靶點(diǎn)，而且在哇巴因介導(dǎo)的EGFR轉(zhuǎn)激活中，Src可引起Tyr845位點(diǎn)的磷酸化。這進(jìn)一步證實(shí)了在氨的刺激下，星形膠質(zhì)細(xì)胞中存在有Src依賴的EGFR轉(zhuǎn)激活。
　　最后，為證明小窩蛋白-1確實(shí)與氨信號(hào)有關(guān)，我們利用RNA干擾技術(shù)降低細(xì)胞中小窩蛋白-1的表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，氯化銨刺激不再能引起ERK的活化。表明小窩蛋白-1在氨刺激引起的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著舉足輕重的作用。
　　上述事實(shí)表明，氨誘導(dǎo)的EGFR轉(zhuǎn)激活及其下游的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)極

22、有可能是其增加星形膠中質(zhì)細(xì)胞內(nèi)哇巴因樣物質(zhì)的生成的結(jié)果。的確，氨可以影響星形膠質(zhì)細(xì)胞中許多蛋白的功能，包括外周型苯二氮卓類受體、膠質(zhì)纖維酸性蛋白、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體、谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體、甘氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體及水通道蛋白-4等。其中，外周型苯二氮卓類受體是星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的與肝性腦病密切相關(guān)的蛋白質(zhì)。該受體激活后能誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞孕烯醇酮神經(jīng)甾體的生成。值得注意的是，在肝性腦病實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型及臨床病人中，體內(nèi)神經(jīng)甾體均有升高。而孕烯醇酮正是哇巴因樣物質(zhì)合成的前

23、體。雖然哇巴因介導(dǎo)氨信號(hào)的可能性有待進(jìn)一步驗(yàn)證，但我們現(xiàn)在的實(shí)驗(yàn)揭示氨刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)的EGFR轉(zhuǎn)激活及其下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與其促進(jìn)各個(gè)相關(guān)的信號(hào)分子在小窩中相互作用有關(guān)。
　　除了激活MAPK/ERK外，哇巴因往往還可引起PI3K/AKT通路的活化。我們?cè)趯?duì)氨信號(hào)的研究中也發(fā)現(xiàn)了其對(duì)AKT的磷酸化激活。但意外的是，氨對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞AKT的活化時(shí)似乎有別于MAPK/ERK。氨對(duì)AKT的活化作用并不依賴于小窩蛋白的參與。我們推測氨對(duì)P

24、I3K/AKT信號(hào)通路的影響可能并不像其激活ERK那樣，借助于小窩中信號(hào)復(fù)合物內(nèi)分子間的相互作用。但這兩個(gè)信號(hào)通路也并非毫無關(guān)系，因?yàn)镻I3K/AKT通路的特異性抑制劑(LY294002和wortrnannin)能夠阻斷氨對(duì)MAPK/ERK的活化，表明PI3K/AKT通路同樣參與了氨刺激下星形膠質(zhì)細(xì)胞ERK的活化。上述關(guān)于氨對(duì)PI3K/AKT通路的影響只是我們的初步研究，尚有許多問題有待闡明，至少包括以下幾個(gè)方面:1）PI3K/AKT與

25、EGFR轉(zhuǎn)激活的關(guān)系，即PI3K/AKT激活是否是EGFR轉(zhuǎn)激活的結(jié)果;2）MAPK/ERK是否反過來也影響PI3K/AKT通路的活化;3) PI3K/AKT和MAPK/ERK間的相互作用機(jī)制如何，即兩者間的對(duì)話發(fā)生在什么水平;4）PI3K/AKT是否也參與氨引起的星形膠質(zhì)細(xì)胞水腫。目前，我們正在對(duì)此進(jìn)行研究。
　　值得注意的是，上述EGFR轉(zhuǎn)激活通路中的各種關(guān)鍵分子與氨誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞水腫有著密切的關(guān)系。提示通過早期轉(zhuǎn)激活EG

26、FR，氨能夠使星形膠質(zhì)細(xì)胞在后期發(fā)生許多重要的改變，包括我們之前發(fā)現(xiàn)的Na，K-ATP酶α2上調(diào)及現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞水腫。既然星形膠質(zhì)細(xì)胞水腫是肝性腦病的主要病理改變，上述信號(hào)通路的闡明無疑對(duì)該病的治療具有重要意義。
　　結(jié)論：
　　在肝性腦病中，病理濃度的氨可以增強(qiáng)EGFR、Na，K-ATP酶α1亞型、Src、ERK及小窩蛋白-1間的相互作用，繼而促進(jìn)Src對(duì)EGFR的轉(zhuǎn)激活。轉(zhuǎn)激活的EGFR則進(jìn)一步激活其下游的Ras-Raf