降脂中藥黃連活性成分調(diào)節(jié)肝臟CYP7A1的作用機制研究.pdf

1、背景：
　　高脂血癥是一種危害性大的疾病，黃連是常用的重要降脂中藥，我們的前期研究發(fā)現(xiàn)黃連的降脂作用與上調(diào)肝臟膽固醇轉(zhuǎn)化成膽酸的關(guān)鍵限速酶—膽固醇7α羥化酶（CYP7A1）有關(guān)，但具體機制未明。
　　目的:
　　通過研究，明確LXRα和PPARα在降脂中藥黃連調(diào)控CYP7A1的作用，并闡明黃連調(diào)節(jié)CYP7A1的物質(zhì)基礎。
　　方法:
　　體內(nèi)研究：健康雄性SD大鼠，體重在180-200g之間，用高脂飼料喂食

2、建立高脂模型，鼠尾取血檢測血清生化指標：總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)。動物分為：正常組，模型組，中藥復方活性成分——黃連生物堿提取物(Coptidis alkaloids extract，CAE)低(50 mg/kg)、中(100 mg/kg)、高(200 mg/kg)劑量組，辛伐他汀(10 mg/kg)組。每組10只，其中正常組給予普通飼料，其他組給予高脂飼料，

3、給藥組每天給予不同劑量 CAE或辛伐他汀，飼養(yǎng)給藥4周，實驗結(jié)束前3天收集糞便樣品，實驗結(jié)束當天麻醉大鼠，經(jīng)眼眶取血或剖腹、腹主動脈采血，砍頭處死大鼠，收集肝組織樣品，檢測大鼠血清TC、TG、HDL-C、LDL-C的含量，檢測肝臟和糞便中的膽固醇、總膽汁酸含量，以及大鼠肝臟微粒體CYP7A1酶活性；提取大鼠肝臟的總RNA，reversr transcription PCR(RT-PCR)檢測目的基因的表達變化。
　　體外研究：(1

4、)小檗堿(Berberine，BBR)對大鼠BRL-3A細胞中CYP7A1、LXRα、PPARα的基因和蛋白表達的影響：培養(yǎng)大鼠正常肝細胞BRL-3A，MTT法確定給藥安全濃度范圍，設置對照組、BBR低(0.3μM)、中(3μM)、高(10μM)劑量組，培養(yǎng)12/24小時，提取細胞樣品的總RNA和蛋白，采用RT-PCR和western blot技術(shù)檢測細胞樣品中CYP7A1、LXRα、PPARα的基因和蛋白表達變化；(2)基因阻斷實驗：

5、培養(yǎng)BRL-3A細胞，給予BBR同時添加LXRα或PPARα的基因阻斷藥物(GGPP/MK-886)，抑制上游調(diào)控因子LXRα或PPARα的表達，培養(yǎng)24小時后提取細胞的總RNA和蛋白，觀察CYP7A1的基因、蛋白表達的變化；(3)高膽固醇誘導實驗：培養(yǎng)BRL-3A細胞，設置空白對照組、高膽固醇組(5μM)、高膽固醇(5μM)+低劑量 BBR組(0.3μM)、高膽固醇(5μM)+高劑量 BBR組(10μM)、高膽固醇(5μM)+低劑量

6、BBR(0.3μM)+GGPP組(10μM)、高膽固醇(5μM)+高劑量BBR(10μM)+GGPP組(10μM)、高膽固醇(5μM)+低劑量BBR(0.3μM)+MK-886組(10μM)、高膽固醇(5μM)+高劑量BBR(10μM)+MK-886組(10μM)，培養(yǎng)細胞24小時后，提取RNA，RT-PCR技術(shù)檢測mRNA表達變化，觀察BBR對高膽固醇刺激下的細胞CYP7A1、LXRα、PPARα的基因調(diào)控。
　　結(jié)果:

7、　　體內(nèi)實驗證明：與模型組比較，CAE能夠顯著降低大鼠血清中TC、TG和LDL-C水平(P<0.05或P<0.01)，還能促進大鼠肝CYP7A1、LXRα和PPARαmRNA的表達，具有劑量依賴性，實驗組間數(shù)據(jù)有顯著性差異(P<0.05或 P<0.01)；并且 CAE能提高大鼠肝臟CYP7A1酶活性，在肝臟中減少膽固醇、增加膽汁酸含量，促進糞便中膽固醇和膽汁酸的排泄(P<0.05或P<0.01)。
　　體外實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)：(1) B

8、BR(給藥后24小時)能促進BRL-3A細胞CYP7A1 mRNA和蛋白的表達，且在給藥后早時段(12小時)時就已經(jīng)促進LXRα和PPARα mRNA和蛋白的表達，實驗組間數(shù)據(jù)有顯著性差異(P<0.05或P<0.01)；(2)添加了LXRα或、PPARα的基因阻斷藥物(GGPP/MK-886)，再給予BBR后CYP7A1的基因、蛋白表達均被抑制，實驗組間數(shù)據(jù)具有顯著性差異(P<0.05或P<0.01)；(3) BRL-3A細胞在高劑量的

9、膽固醇刺激下，CYP7A1 mRNA表達升高，而LXRα和PPARαmRNA則有所降低；同時加入BBR后，CYP7A1 mRNA表達量升高更為顯著(P<0.05或P<0.01)且具有劑量依賴性，BBR對LXRα mRNA的促進作用在低劑量時達到最強，而PPARαmRNA的表達則與CYP7A1相似。阻斷LXRα/PPARα基因表達后，CYP7A1 mRNA的表達均受到抑制(P<0.05或P<0.01)。
　　結(jié)論:
　　降脂中

10、藥黃連活性組分對飲食性高脂血癥大鼠有良好的降膽固醇治療作用，其可能的作用機制包括：
　　(1)增強肝臟CYP7A1 mRNA表達，提高CYP7A1酶活性，促進肝臟中膽固醇向膽汁酸轉(zhuǎn)化，以及膽固醇在機體的轉(zhuǎn)化排泄，從而降低體內(nèi)膽固醇水平，改善高膽固醇血癥、高脂血癥的癥狀。CAE是中藥降脂方FTZ降膽固醇的主要活性組分；
　　(2)CAE的主要活性成分 BBR，通過促進 CYP7A1上游調(diào)控因子 LXRα/PPARαmRNA的表