空腸彎曲菌cheY,ciaB,dnaJ,cfrA基因的克隆及其真核表達載體的構(gòu)建.pdf

1、空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni,C.jejuni)作為人類的食源性病原菌,是引起急性胃腸道感染的主要病原菌之一。同時,空腸彎曲菌還與人類急性炎癥性脫髓鞘性多發(fā)性神經(jīng)病,即吉蘭-巴雷綜合征(GuillainBarrésyndrome,GBS)的發(fā)生密切相關(guān),是導致人類發(fā)生急性遲緩性癱瘓的重要病因。近年,分子生物學技術(shù)以及基因工程技術(shù)得到了長足的發(fā)展,使得人們對空腸彎曲菌在分子生物學方面的機制有了深入的研究,特別是20

2、00年公布了C.jejuni NCTC11168(penner0:2血清型)的全基因組序列以來,使得研究C.jejuni在分子水平的致病機制方面有了新的前景?？漳c彎曲菌的致病機制主要包括侵襲、粘附、定植、產(chǎn)毒素,以及分子模擬等方面。已有研究表明,多種毒力因子共同參與空腸彎曲菌的致病過程。
　　 目的:本研究從基因水平出發(fā),應(yīng)用本地區(qū)已經(jīng)證實的具有致吉蘭-巴雷綜合癥特性的空腸彎曲菌血清型penner O:19 lulei菌株,選擇

3、該菌株中具有侵襲、粘附、定植及產(chǎn)毒素等特性的14個致病相關(guān)基因進行TA克隆,經(jīng)測序后,與Genebank中C.jejuni NCTC11168中的相應(yīng)基因進行比對分析,觀察相似性。再選擇14個基因中,保守性、免疫原性相對較強的4個基因進行克隆,并插入真核表達載體pEF neo-myc,獲得真核表達,為空腸彎曲菌基因工程疫苗的研制打下基礎(chǔ)。
　　 方法:擴增目的基因以C.jeiuni penner O:19 lulei菌株為模板,

4、用PCR的方法分別擴增grpE、dnaK、cheW、theY、cheV、flaA、cdtA、cdtB、cdtC、peb2、pebC、ciaB、dnaJ、cfrA14個目的基因。
　　 TA克隆將14個目的基因分別連接到pGEM-T Easy載體,完成TA克隆。轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)Top10或DH5a。經(jīng)培養(yǎng)后獲得質(zhì)粒,對質(zhì)粒進行酶切后凝膠電泳檢測及測序鑒定。應(yīng)用DNASTAR軟件與C.jejuni penner O:19 lul

5、ei菌株DNA序列及NCTC11168中的相應(yīng)基因進行比對分析,得到相似指數(shù)。
　　 構(gòu)建真核表達載體選擇14個目的基因中,保守性、免疫原性較強的4個基因cheY、ciaB、dnaJ、cfrA,用Pyrobest PCR的方法擴增4個基因后,應(yīng)用真核質(zhì)粒載體pEF neo-myc,以Kpn I和EcoR V,或Kpn I和Spe I為酶切位點,分別構(gòu)建真核表達載體。經(jīng)轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài),得到質(zhì)粒并測序成功后,轉(zhuǎn)染293T細胞。轉(zhuǎn)

6、染成功后用Western Blotting的方法檢測蛋白的表達。
　　 結(jié)果:成功擴增并TA克隆出目的基因grpE、dnaK、cheW、cheY、cheV、flaA、cdtA、cdtB、cdtC、peb2、pebC、ciaB、dnaJ,由于基因cfrA片段長度太大,將其分成兩段進行擴增并TA克隆。轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)并培養(yǎng)后,所得質(zhì)粒經(jīng)凝膠電泳檢測,并測序鑒定后,應(yīng)用DNASTAR軟件與C.jejuni penner O:19 l

7、ulei菌株DNA序列及NCTC11168中的相應(yīng)基因進行比對分析。所得目的基因與C.jejuni penner O:19 lulei菌株DNA序列相同;與C.jejuni NCTC11168比對,得出結(jié)果:基因dnaK、cheW、cheY、cheV、cdtA、cdtB、cdtC、peb2、pebC、ciaB、dnaJ、cfrA-1的相似指數(shù)分別在95.1％-100％,flaA的相似指數(shù)為92.6％,grpE的相似指數(shù)為89.9％,cf

8、rA-2的相似指數(shù)＜50％。應(yīng)用真核質(zhì)粒載體pEF neo-myc,成功構(gòu)建了基因cheY、ciaB、dnaJ及cfrA的真核表達載體。用Western Blotting的方法檢測到CheY',CiaB'及DanJ'蛋白的表達,但未檢測到CfrA-1',CfrA-2'蛋白的表達。
　　 結(jié)論:成功擴增并TA克隆出與空腸彎曲菌侵襲、粘附、定植及產(chǎn)毒素等特性相關(guān)的14個致病相關(guān)基因。應(yīng)用DNASTAR軟件與C.jejunipenne