中國明對蝦先天免疫的模式識別與效應(yīng)分子.pdf

1、本研究通過淘選噬菌體展示文庫、同源克隆和抑制性消減雜交的方法從中國明對蝦中分別克隆得到了圍食膜蛋白基因、脂多糖-β-1，3-葡聚糖結(jié)合蛋白(LGBP)和三種抗菌肽(crustin)基因，并對這些基因的性質(zhì)做了進(jìn)一步研究。這些研究使我們對中國明對蝦免疫的模式識別和效應(yīng)分子有了進(jìn)一步的認(rèn)識。 一、中國明對蝦圍食膜蛋白基因克隆和性質(zhì)研究我們用弧菌和金黃色葡萄球菌刺激中國明對蝦以后，提取其血細(xì)胞的總RNA。再提取mRNA后用其構(gòu)建了T7

2、噬菌體展示文庫。選擇了多種配體來進(jìn)行文庫淘選，在用大腸桿菌經(jīng)過3輪淘選以后獲得了一段圍食膜蛋白的基因。在這一片段的基礎(chǔ)上設(shè)計基因特異性引物利用RACE和SMART cDNA技術(shù)獲得了基因的全長。中國明對蝦圍食膜蛋白基因(Fc-PTPH)全長為1028bp，開放閱讀框為822bp，共編碼274個氨基酸。基因的5’端含有17bp的非編碼區(qū)，3’端含有209bp的非編碼區(qū)。這一基因編碼的蛋白為30.6kDa，其理論等電點為4.92。蛋白前20

3、個氨基酸為信號肽序列，其含有4個圍食膜蛋白A樣結(jié)構(gòu)域(peritrophinA-like domains)，經(jīng)過SMART預(yù)測，其中后三個為幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域(chitin-binding domains，CBDs)。 通過Northern blot和RT-PCR研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)c-PTPH組成性高表達(dá)于卵巢中，在肝胰腺中沒有表達(dá)，而在其它組織(血細(xì)胞、心、胃、鰓、腸、精巢)中細(xì)菌刺激才能誘導(dǎo)這一基因的表達(dá)。我們還用Northern

4、blot方法研究了Fc-PTPH在腸和卵巢中細(xì)菌刺激后不同時間的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，在腸中刺激16小時后能夠檢測到基因的表達(dá)，在24小時時表達(dá)量達(dá)到最高。而在卵巢中，在刺激后不同時間Fc-PTPH的表達(dá)沒有變化，一直維持著高表達(dá)模式。原位雜交顯示這一基因的mRNA存在于顆粒血細(xì)胞和卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。設(shè)計了成熟肽表達(dá)引物，經(jīng)過PCR擴增后連入pET-30a(+)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)進(jìn)行原核表達(dá)。由于表達(dá)產(chǎn)物形成包涵體，所

5、以只有經(jīng)過變性復(fù)性后，才能利用His-Bind親和層析柱進(jìn)行純化。利用純化的蛋白作為抗原刺激家兔獲得了多克隆抗血清，免疫雙擴散顯示抗體滴度可以達(dá)到8倍稀釋。Westernblot檢測也能獲得清晰、特異的條帶。 二、中國明對蝦脂多糖-β-1，3-葡聚糖(LGBP)基因克隆和性質(zhì)研究根據(jù)相近物種的同一類基因設(shè)計了兩對兼并引物，巢式PCR后獲得了中國明對蝦LGBP基因(Fc-LGBP)的中間片段，再根據(jù)這一片段設(shè)計引物從血細(xì)胞SMAR

6、T cDNA中克隆得到了基因全長?；蛉L為1253bp，包含1101bp的開放閱讀框。在基因的5'端含有7bp的非編碼區(qū)，3'端含有129bp的非編碼區(qū)。這一基因編碼的蛋白質(zhì)由366個氨基酸構(gòu)成，其中前17個氨基酸為信號肽序列。預(yù)測成熟肽分子量為39.8kDa，等電點為4.43。通過軟件預(yù)測，中國明對蝦LGBP含有兩個N糖基化位點和一個細(xì)胞粘連位點(Arg-Gly-Asp，RGD)。從蛋白94位氨基酸至312位氨基酸是一個糖基水解酶結(jié)

7、構(gòu)域。 選取正常及細(xì)菌刺激的血細(xì)胞、心、肝胰腺、胃、鰓、腸的總RNA進(jìn)行Northern blot分析，結(jié)果顯示Fc-LGBP僅表達(dá)于血細(xì)胞中，細(xì)菌刺激24小時后基因表達(dá)量下降。這一結(jié)果在RT-PCR中得到了進(jìn)一步驗證，但是由于RT-PCR更靈敏一些，還可以在肝胰腺和鰓中檢測到基因的表達(dá)，但是其表達(dá)很弱。我們選取了多種組織來研究Fc-LGBP基因表達(dá)的組織定位，原位雜交顯示Fc-LGBP基因的mRNA只存在于顆粒細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。

8、 根據(jù)基因序列設(shè)計成熟肽表達(dá)引物，將基因片段克隆到載體pET-30a(+)中，轉(zhuǎn)化其感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行原核表達(dá)。重組表達(dá)的蛋白也形成包涵體，變性、復(fù)性以后用His-Bind親和柱進(jìn)行純化。利用重組表達(dá)并純化的LGBP作為抗原免疫家兔，9周后獲得多克隆抗血清。 在獲得了LGBP多克隆抗體以后，我們研究了LGBP蛋白在不同組織中的分布。首先利用免疫組化的方法研究了LGBP的組織定位，一抗反應(yīng)后，再用FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG檢測

9、，在熒光顯微鏡下可以觀察到LGBP蛋白定位于絕大多數(shù)血細(xì)胞的細(xì)胞膜上，形成顆粒狀的熒光信號。利用多克隆抗體，我們還研究了LGBP蛋白在對蝦各組織中的表達(dá)模式。將對蝦各組織(血漿、血細(xì)胞、心、肝胰腺、鰓)蛋白進(jìn)行SDS-PAGE并轉(zhuǎn)膜后，用LGBP多克隆抗體進(jìn)行標(biāo)記，再用辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG進(jìn)行二抗標(biāo)記，顯色后發(fā)現(xiàn)，天然的LGBP蛋白主要存在于血細(xì)胞中，在肝胰腺也有較弱的表達(dá)，天然蛋白的分子量約為40kDa。在其它組織中則沒有

10、檢測到蛋白的存在。 三、中國明對蝦三種甲殼肽(crustin)類抗菌肽的基因克隆和性質(zhì)研究我們在中國明對蝦血細(xì)胞抑制性消減雜交(suppression subtractivehybridization，SSH)文庫測序的EST中發(fā)現(xiàn)了一段序列與erustin基因相似，根據(jù)這段序列設(shè)計特異性前引物從血細(xì)胞SMART-cDNA中獲得了基因的3’端，又設(shè)計特異性后引物，獲得了基因5’端的部分序列，將此基因命名為Fc-crustin Ⅰ

11、。在擴增Fc-crustin Ⅰ的5’端時，獲得的片段與已經(jīng)獲得的Fc-crustin Ⅰ的部分序列除引物外不能完全重疊，便命名為Fc-crustin Ⅱ；根據(jù)這一基因片段設(shè)計基因特異性引物，獲得了Fc-crustin Ⅱ基因的完整序列。在Fc-crustin Ⅰ 3’端克隆時，在卵巢組織中獲得的片段與預(yù)期大小不一致，將其克隆測序后是一條具有完整的3，端的EST，BLAST結(jié)果顯示其與crustin具有較高的同源性，便命名為Fe-cru

12、stinⅢ；根據(jù)Fc-crustin Ⅲ的這一序列設(shè)計引物獲得了這一基因的全序列。 已經(jīng)獲得的Fc-crustin Ⅰ部分基因序列含有完整的乳清酸性蛋白(whey acidicprotein，WAP)結(jié)構(gòu)域，位于基因的3’端由49個氨基酸構(gòu)成。 Fc-crustin Ⅱ基因全長473bp，包含一個390bp的開放閱讀框，編碼130個氨基酸。在基因的5’端有4bp的非編碼序列，3’端的非編碼序列為79bp。通過ExPASy

13、網(wǎng)站在線預(yù)測，這一基因編碼的蛋白分子量為14.0kDa，其理論等電點為8．60。蛋白前17個氨基酸為信號肽序列，蛋白C端83.124位氨基酸形成WAP結(jié)構(gòu)域。 Fc-crustin Ⅲ基因全長為574bp，其開放閱讀框為462bp，共編碼154個氨基酸?；?’端和3’端的非編碼區(qū)分別為38bp和74bp。通過軟件預(yù)測Fc-crustinⅢ基因編碼的蛋白分子量為17.79kDa，其理論等電點為4.64。前20個氨基酸形成信號肽，62-1

14、27位氨基酸構(gòu)成WAP結(jié)構(gòu)域。 選取正常及細(xì)菌刺激24小時中國明對蝦血細(xì)胞、心、肝胰腺、胃、鰓、腸、卵巢和精巢組織，利用RT-PCR方法分析三種crustin基因的表達(dá)模式。結(jié)果顯示Fc-crustin I基因廣泛表達(dá)于各種組織，在血細(xì)胞中表達(dá)量最高，精巢中表達(dá)量最低。在多數(shù)組織中細(xì)菌刺激前后Fc-crustin Ⅰ表達(dá)變化不大，但是在胃中刺激后表達(dá)上調(diào)比較明顯。Fc-crustin Ⅱ也廣泛表達(dá)于各種組織中，在各組織中的表達(dá)差

15、異與Fc-erustin I相似，在血細(xì)胞中的表達(dá)量最高。細(xì)菌刺激后在心、鰓、卵巢組織中表達(dá)上調(diào)比較明顯，而在其它組織中，刺激前后表達(dá)變化不大。Fc-crustinⅢ的表達(dá)模式同Ⅰ和Ⅱ差別比較大，F(xiàn)c-crustin Ⅲ只表達(dá)于少數(shù)幾種組織中，包括正常心、刺激胃、正常卵巢和刺激卵巢。另外，在刺激的心和腸中有少量表達(dá)。在其余組織中則沒有檢測到Fc-crustin Ⅲ基因的表達(dá)。 設(shè)計成熟肽表達(dá)引物，將Fc-crustin Ⅱ和Fc

16、-crustin Ⅲ分別克隆入pET-30(+)，然后轉(zhuǎn)入大腸桿菌進(jìn)行原核表達(dá)。利用His-Bind親和柱純化以后檢測其抑菌活性，結(jié)果表明原核重組表達(dá)的Fc-crustin Ⅱ和Fc-crustin Ⅲ的成熟肽對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌都沒有抑制活性。又重新設(shè)計表達(dá)前引物，將信號肽一起進(jìn)行原核重組表達(dá)，用管碟法檢測后，F(xiàn)c-crustin Ⅲ重組表達(dá)蛋白的抑菌活性沒有檢測到，而Fc-crustin Ⅱ?qū)μ冱S微球菌和金黃色葡萄球菌兩種革