16個氨基酸多肽對伴刀豆蛋白A誘導的急性免疫性肝損傷的作用及其機制的初步研究.pdf

1、目的:病毒感染、自身免疫狀態(tài)、酒精的攝入及一些特定藥物的使用，均可以導致肝炎的發(fā)生，而且易進展為肝硬化、肝衰竭或肝癌。盡管目前有許多治療方法可以促進肝功能的恢復，但是仍有很大比例的肝炎患者對于治療無有效應答，甚至有些患者最終需要進行肝臟移植手術(shù)。伴刀豆蛋白A(Concanavalin A，Con A)誘導的小鼠肝損傷模型可以較好地模擬人類病毒性肝炎、自身免疫性肝炎和急性肝衰竭的病理生理學。經(jīng)Con A刺激可導致小鼠肝細胞壞死和凋亡，伴隨

2、血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransaminase，ALT)和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)升高，并且有大量的T細胞、NKT細胞和Kuffer細胞等淋巴細胞向肝臟浸潤。本室前期研究發(fā)現(xiàn)16個氨基酸多肽在輕中重度慢性乙肝患者血清中有差異性表達，且通過體外實驗證實16個氨基酸多肽有促進肝細胞增殖的作用。
　　本研究通過建立Con A誘導的肝損傷模型，來探討外源性給予人工

3、合成的16個氨基酸多肽對急性免疫性肝損傷的作用，并對其機制進行初步研究。
　　方法:
　　1、16個氨基酸多肽預防性給藥對Con A誘導肝損傷的作用:將56只雄性6-8周齡Balb/c小鼠隨機分為7組，除正常對照組給予2次生理鹽水外，各組小鼠分別經(jīng)尾靜脈給予0.25 ml NS，500μg/kg體重地塞米松或200、400、800、1600μg/kg體重16個氨基酸多肽，1h后經(jīng)尾靜脈注射12 mg/kg體重ConA，注射C

4、onA12 h后處死小鼠進行后續(xù)實驗。
　　2、16個氨基酸多肽治療性給藥對Con A誘導肝損傷的作用:將32只小鼠隨機分成4組，除正常對照組注射2次生理鹽水外，其他各組小鼠經(jīng)尾靜脈注射12 mg/kg Con A，30 min后，分別經(jīng)尾靜脈給予0.25 ml NS，500μg/kg體重地塞米松或者800μg/kg體重16個氨基酸多肽。12h后處死小鼠，進行后續(xù)實驗。
　　3、16個氨基酸多肽對致死劑量Con A誘導肝損傷

5、小鼠生存率的影響:將60只小鼠隨機分為兩大組，即預防性給藥組和治療性給藥組，每組30只。然后再將每個大組隨機分為3組，每組10只。各組均于尾靜脈注射致死劑量25 mg/kg體重Con A1h前（預防性給藥）或30min后（治療性給藥）分別經(jīng)尾靜脈注射0.25 ml NS、500μg/kg體重地塞米松或800μg/kg體重16個氨基酸多肽，觀察ConA注射后72小時內(nèi)小鼠的生存情況，每小時記錄一次。
　　4、血清ALT和AST檢測:

6、于Con A刺激后12h收集小鼠血液，分離血清，采用全自動生化分析儀檢測血清ALT和AST水平。
　　5、肝組織病理學檢測:經(jīng)Con A刺激后12 h分離肝臟，于同一位置取合適大小的肝組織進行固定，石蠟包埋，行5μm連續(xù)切片后進行HE染色，于光學顯微鏡下觀察肝組織病理學形態(tài)，并采集圖像。
　　6、肝細胞凋亡和肝細胞周期檢測:Con A注射后12h，分離肝組織，應用酶消化法分離肝細胞，經(jīng)PI染色后采用流式細胞儀分析肝細胞凋亡和

7、細胞周期。
　　7、肝組織各淋巴細胞浸潤比例檢測:Con A刺激后12h，分離肝組織，應用密度梯度離心法分離淋巴細胞，經(jīng)FITC-CD3e-Ab和PE-DX5-Ab標記后采用流式細胞儀分析肝臟T細胞、NK細胞、NKT細胞浸潤情況。
　　結(jié)果:
　　1、16個氨基酸多肽預防性給藥對ConA誘導肝損傷的影響:經(jīng)ConA刺激12h后，ConA模型組小鼠血清ALT和AST水平顯著高于正常對照組（均P＜0.001）;不同劑量16

8、個氨基酸多肽預防性給藥均顯著降低了血清ALT和AST水平（均P＜0.05），并且存在劑量反應關系，800μg/kg劑量組效果最好;地塞米松預防性給藥也顯著降低了血清ALT和AST水平，與16個氨基酸多肽800μg/kg劑量組相比，差異無統(tǒng)計學意義。組織病理學結(jié)果可見，Con A模型組小鼠肝組織出現(xiàn)大量肝細胞壞死，而各劑量16個氨基酸多肽預防性給藥及地塞米松預防性給藥均能使之顯著改善，未見明顯壞死。
　　2、16個氨基酸多肽預防性給

9、藥對注射致死劑量Con A小鼠生存率的影響:800μg/kg體重16個氨基酸多肽或地塞米松預防性給藥均可以顯著改善Con A誘導肝損傷小鼠的生存情況，生存率由20％分別提高至70％和80％(P值分別為0.01和0.004)，中位生存時間由11h均延長至72 h。
　　3、16個氨基酸多肽預防性給藥對Con A誘導肝細胞凋亡的影響:ConA模型組小鼠凋亡肝細胞比例為30.25±1.29％，顯著高于正常對照組的5.32±0.58％(P

10、＜0.001);各劑量的16個氨基酸多肽預防性給藥組凋亡肝細胞百分比分別為8.72±0.60％，5.88±2.98％，5.45±1.96％和4.68±1.10％，均顯著低于Con A模型組（均P＜0.001）;地塞米松預防性給藥也顯著減少肝細胞凋亡至8.40±2.02％(P＜0.001)，但效果較16個氨基酸多肽1600μg/kg劑量組略差(P＜0.05)。
　　4、16個氨基酸多肽預防性給藥對Con A誘導肝損傷小鼠肝細胞周期的

11、影響:除200μg/kg體重16個氨基酸多肽預防性給藥組肝細胞周期與Con A模型組差別無統(tǒng)計學意義外，其他劑量16個氨基酸多肽預防性給藥組G2/M期肝細胞百分比較模型組增多（均P＜0.01），G1期肝細胞百分比較模型組減少(均P＜0.05)。地塞米松預防性給藥組G1期肝細胞百分比明顯增多，S期和G2/M期肝細胞百分比均下降（均P＜0.01）。
　　5、16個氨基酸多肽預防性給藥對Con A誘導的肝組織各淋巴細胞浸潤比例的影響:C

12、on A模型組小鼠肝組織內(nèi)T細胞和NKT細胞顯著多于正常對照組（均P＜0.05），而400，800μg/kg體重16個氨基酸多肽預防性給藥組（均P＜0.01）與地塞米松預防性給藥組(P＜0.001)均可以顯著減少T細胞和NKT細胞所占比例。
　　6、16個氨基酸多肽治療性給藥對ConA誘導肝損傷的影響:Con A刺激后給予800μg/kg體重16個氨基酸多肽或地塞米松治療均顯著降低了血清ALT和AST水平（均P＜0.001），同時

13、也改善了肝細胞壞死情況。
　　7、16個氨基酸多肽治療性給藥對注射致死劑量Con A小鼠生存率的影響:800μg/kg體重16個氨基酸多肽或地塞米松治療改善了小鼠生存情況，將生存率由20％提高至40％和60％(P值分別為0.029，0.011)。中位生存時間由13h延長至37h和72 h。
　　結(jié)論:
　　1、外源性給予16個氨基酸多肽可以有效預防和治療Con A誘導的肝損傷，并且可以改善注射致死劑量ConA小鼠的生存