16個(gè)氨基酸多肽對(duì)伴刀豆蛋白A誘導(dǎo)的急性免疫性肝損傷的作用及其機(jī)制的初步研究.pdf

1、目的:病毒感染、自身免疫狀態(tài)、酒精的攝入及一些特定藥物的使用，均可以導(dǎo)致肝炎的發(fā)生，而且易進(jìn)展為肝硬化、肝衰竭或肝癌。盡管目前有許多治療方法可以促進(jìn)肝功能的恢復(fù)，但是仍有很大比例的肝炎患者對(duì)于治療無(wú)有效應(yīng)答，甚至有些患者最終需要進(jìn)行肝臟移植手術(shù)。伴刀豆蛋白A(Concanavalin A，Con A)誘導(dǎo)的小鼠肝損傷模型可以較好地模擬人類病毒性肝炎、自身免疫性肝炎和急性肝衰竭的病理生理學(xué)。經(jīng)Con A刺激可導(dǎo)致小鼠肝細(xì)胞壞死和凋亡，伴隨

2、血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransaminase，ALT)和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)升高，并且有大量的T細(xì)胞、NKT細(xì)胞和Kuffer細(xì)胞等淋巴細(xì)胞向肝臟浸潤(rùn)。本室前期研究發(fā)現(xiàn)16個(gè)氨基酸多肽在輕中重度慢性乙肝患者血清中有差異性表達(dá)，且通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)16個(gè)氨基酸多肽有促進(jìn)肝細(xì)胞增殖的作用。
　　本研究通過(guò)建立Con A誘導(dǎo)的肝損傷模型，來(lái)探討外源性給予人工

3、合成的16個(gè)氨基酸多肽對(duì)急性免疫性肝損傷的作用，并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行初步研究。
　　方法:
　　1、16個(gè)氨基酸多肽預(yù)防性給藥對(duì)Con A誘導(dǎo)肝損傷的作用:將56只雄性6-8周齡Balb/c小鼠隨機(jī)分為7組，除正常對(duì)照組給予2次生理鹽水外，各組小鼠分別經(jīng)尾靜脈給予0.25 ml NS，500μg/kg體重地塞米松或200、400、800、1600μg/kg體重16個(gè)氨基酸多肽，1h后經(jīng)尾靜脈注射12 mg/kg體重ConA，注射C

4、onA12 h后處死小鼠進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　2、16個(gè)氨基酸多肽治療性給藥對(duì)Con A誘導(dǎo)肝損傷的作用:將32只小鼠隨機(jī)分成4組，除正常對(duì)照組注射2次生理鹽水外，其他各組小鼠經(jīng)尾靜脈注射12 mg/kg Con A，30 min后，分別經(jīng)尾靜脈給予0.25 ml NS，500μg/kg體重地塞米松或者800μg/kg體重16個(gè)氨基酸多肽。12h后處死小鼠，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　3、16個(gè)氨基酸多肽對(duì)致死劑量Con A誘導(dǎo)肝損傷

5、小鼠生存率的影響:將60只小鼠隨機(jī)分為兩大組，即預(yù)防性給藥組和治療性給藥組，每組30只。然后再將每個(gè)大組隨機(jī)分為3組，每組10只。各組均于尾靜脈注射致死劑量25 mg/kg體重Con A1h前（預(yù)防性給藥）或30min后（治療性給藥）分別經(jīng)尾靜脈注射0.25 ml NS、500μg/kg體重地塞米松或800μg/kg體重16個(gè)氨基酸多肽，觀察ConA注射后72小時(shí)內(nèi)小鼠的生存情況，每小時(shí)記錄一次。
　　4、血清ALT和AST檢測(cè):

6、于Con A刺激后12h收集小鼠血液，分離血清，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清ALT和AST水平。
　　5、肝組織病理學(xué)檢測(cè):經(jīng)Con A刺激后12 h分離肝臟，于同一位置取合適大小的肝組織進(jìn)行固定，石蠟包埋，行5μm連續(xù)切片后進(jìn)行HE染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織病理學(xué)形態(tài)，并采集圖像。
　　6、肝細(xì)胞凋亡和肝細(xì)胞周期檢測(cè):Con A注射后12h，分離肝組織，應(yīng)用酶消化法分離肝細(xì)胞，經(jīng)PI染色后采用流式細(xì)胞儀分析肝細(xì)胞凋亡和

7、細(xì)胞周期。
　　7、肝組織各淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)比例檢測(cè):Con A刺激后12h，分離肝組織，應(yīng)用密度梯度離心法分離淋巴細(xì)胞，經(jīng)FITC-CD3e-Ab和PE-DX5-Ab標(biāo)記后采用流式細(xì)胞儀分析肝臟T細(xì)胞、NK細(xì)胞、NKT細(xì)胞浸潤(rùn)情況。
　　結(jié)果:
　　1、16個(gè)氨基酸多肽預(yù)防性給藥對(duì)ConA誘導(dǎo)肝損傷的影響:經(jīng)ConA刺激12h后，ConA模型組小鼠血清ALT和AST水平顯著高于正常對(duì)照組（均P＜0.001）;不同劑量16

8、個(gè)氨基酸多肽預(yù)防性給藥均顯著降低了血清ALT和AST水平（均P＜0.05），并且存在劑量反應(yīng)關(guān)系，800μg/kg劑量組效果最好;地塞米松預(yù)防性給藥也顯著降低了血清ALT和AST水平，與16個(gè)氨基酸多肽800μg/kg劑量組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。組織病理學(xué)結(jié)果可見(jiàn)，Con A模型組小鼠肝組織出現(xiàn)大量肝細(xì)胞壞死，而各劑量16個(gè)氨基酸多肽預(yù)防性給藥及地塞米松預(yù)防性給藥均能使之顯著改善，未見(jiàn)明顯壞死。
　　2、16個(gè)氨基酸多肽預(yù)防性給

9、藥對(duì)注射致死劑量Con A小鼠生存率的影響:800μg/kg體重16個(gè)氨基酸多肽或地塞米松預(yù)防性給藥均可以顯著改善Con A誘導(dǎo)肝損傷小鼠的生存情況，生存率由20％分別提高至70％和80％(P值分別為0.01和0.004)，中位生存時(shí)間由11h均延長(zhǎng)至72 h。
　　3、16個(gè)氨基酸多肽預(yù)防性給藥對(duì)Con A誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡的影響:ConA模型組小鼠凋亡肝細(xì)胞比例為30.25±1.29％，顯著高于正常對(duì)照組的5.32±0.58％(P

10、＜0.001);各劑量的16個(gè)氨基酸多肽預(yù)防性給藥組凋亡肝細(xì)胞百分比分別為8.72±0.60％，5.88±2.98％，5.45±1.96％和4.68±1.10％，均顯著低于Con A模型組（均P＜0.001）;地塞米松預(yù)防性給藥也顯著減少肝細(xì)胞凋亡至8.40±2.02％(P＜0.001)，但效果較16個(gè)氨基酸多肽1600μg/kg劑量組略差(P＜0.05)。
　　4、16個(gè)氨基酸多肽預(yù)防性給藥對(duì)Con A誘導(dǎo)肝損傷小鼠肝細(xì)胞周期的

11、影響:除200μg/kg體重16個(gè)氨基酸多肽預(yù)防性給藥組肝細(xì)胞周期與Con A模型組差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，其他劑量16個(gè)氨基酸多肽預(yù)防性給藥組G2/M期肝細(xì)胞百分比較模型組增多（均P＜0.01），G1期肝細(xì)胞百分比較模型組減少(均P＜0.05)。地塞米松預(yù)防性給藥組G1期肝細(xì)胞百分比明顯增多，S期和G2/M期肝細(xì)胞百分比均下降（均P＜0.01）。
　　5、16個(gè)氨基酸多肽預(yù)防性給藥對(duì)Con A誘導(dǎo)的肝組織各淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)比例的影響:C

12、on A模型組小鼠肝組織內(nèi)T細(xì)胞和NKT細(xì)胞顯著多于正常對(duì)照組（均P＜0.05），而400，800μg/kg體重16個(gè)氨基酸多肽預(yù)防性給藥組（均P＜0.01）與地塞米松預(yù)防性給藥組(P＜0.001)均可以顯著減少T細(xì)胞和NKT細(xì)胞所占比例。
　　6、16個(gè)氨基酸多肽治療性給藥對(duì)ConA誘導(dǎo)肝損傷的影響:Con A刺激后給予800μg/kg體重16個(gè)氨基酸多肽或地塞米松治療均顯著降低了血清ALT和AST水平（均P＜0.001），同時(shí)

13、也改善了肝細(xì)胞壞死情況。
　　7、16個(gè)氨基酸多肽治療性給藥對(duì)注射致死劑量Con A小鼠生存率的影響:800μg/kg體重16個(gè)氨基酸多肽或地塞米松治療改善了小鼠生存情況，將生存率由20％提高至40％和60％(P值分別為0.029，0.011)。中位生存時(shí)間由13h延長(zhǎng)至37h和72 h。
　　結(jié)論:
　　1、外源性給予16個(gè)氨基酸多肽可以有效預(yù)防和治療Con A誘導(dǎo)的肝損傷，并且可以改善注射致死劑量ConA小鼠的生存