百合主要病毒的分子檢測(cè)及脫毒技術(shù)研究.pdf

1、百合是一種集觀賞、食用、藥用價(jià)值于一身的重要經(jīng)濟(jì)作物。近年來(lái)，病毒病的發(fā)生導(dǎo)致百合切花及種球品質(zhì)嚴(yán)重下降，制約了百合生產(chǎn)的發(fā)展。因此，建立快速、準(zhǔn)確的百合病毒檢測(cè)體系和有效的脫毒體系是減少病毒對(duì)百合的危害、恢復(fù)種性的關(guān)鍵問(wèn)題之一。 本研究選取對(duì)危害百合危害最嚴(yán)重的黃瓜花葉病毒(CMV)、百合無(wú)癥病毒(LSV)、百合斑駁病毒(LMoV)作為研究對(duì)象，基于病毒外殼蛋白(CP)核酸序列設(shè)計(jì)引物，建立了三重 RT-PCR 病毒檢測(cè)體系；

2、克隆了北京百合樣品的三種病毒CP基因全序列，并應(yīng)用該體系對(duì)部分百合栽培品種、組培苗及野生種的病毒發(fā)生情況進(jìn)行了調(diào)查；對(duì)感染病毒的鐵炮系‘雪皇后’品種進(jìn)行了系統(tǒng)的脫毒研究。主要研究結(jié)果如下： 根據(jù)基因庫(kù)中CMV、LMoV、LSV的CP基因序列，設(shè)計(jì)了3對(duì)特異引物，通過(guò)對(duì)擴(kuò)增條件的優(yōu)化，可從帶有 CMV、LMoV 和 LSV 的樣品中同時(shí)擴(kuò)增出3條與試驗(yàn)設(shè)計(jì)大小相符的 657bp(CMV)、428bp(LMoV)、171 bp(LS

3、V)的特異條帶。通過(guò)同源關(guān)系鑒定可知：本研究所獲得的3種病毒CP基因與GenBank中登錄的其它分離物核苷酸同源性在90％以上，地域差異不顯著，外殼蛋白序列高度保守。 針對(duì)3種病毒的CP全序列設(shè)計(jì)引物，分別進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，獲得鐵炮百合‘雪皇后’品種的3種病毒外殼蛋白基因全序列。片斷大小分別為CMV (657bp)，LMoV (825bp)，LSV (844bp)。通過(guò)NCBI的Submission程序在GenBank上登錄

4、，獲得序列號(hào)EF158108，EF158109，EF158110。 應(yīng)用已建立的多重 RT-PCR 方法，對(duì)百合田間栽培品種、組培苗和野生群體進(jìn)行病毒檢測(cè)。結(jié)果表明：抽檢的9個(gè)田間栽培品種均受LMoV 和 LSV復(fù)合侵染，病毒在同一栽培區(qū)域內(nèi)相互傳播，使該栽培區(qū)域的百合全部感染病毒。抽檢的8個(gè)組培苗品種中，3個(gè)樣品LSV呈陽(yáng)性，證明該方法可以用于脫毒組培苗的病毒檢測(cè)。對(duì)岷江百合(Lilium regale)7個(gè)群體的檢測(cè)結(jié)果表明

5、：采自四川茂縣石大關(guān)鄉(xiāng)的樣品，LSV呈陽(yáng)性。這是國(guó)內(nèi)首次報(bào)道在野生種的岷江百合中檢測(cè)到該病毒。通過(guò)核苷酸同源性分析可知，該岷江百合CP基因序列與其它分離物同源性很高，達(dá)到98.5％-99％。 采用莖尖培養(yǎng)與病毒唑相結(jié)合的方法，設(shè)計(jì)莖尖大小與病毒唑濃度的不同組合，最終確定病毒唑濃度4mg/L，莖尖大小在 0.5-0.7mm 范圍內(nèi)為最優(yōu)。該組合能保證較高的成活率和脫毒率，且操作簡(jiǎn)便，莖尖生長(zhǎng)周期短，成苗快。 最后本研究初步