熊果酸對NADPH氧化酶亞基在靜止型肝星狀細胞活化過程中表達及功能的影響.pdf

1、背景：
　　肝纖維化由各種慢性肝損傷引起的肝臟過度修復反應造成，主要以I型膠原為主的細胞外基質(zhì)（extracellular matrix,ECM）在肝臟內(nèi)過度沉積為特征?；罨母涡菭罴毎╤epatic stellate cells,HSCs）是ECM的主要來源，所以靜止型HSC向活化型HSC激活、轉(zhuǎn)化的過程是肝纖維化的中心事件。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（NADPH oxidase,NOX）及其產(chǎn)生的活性氧簇（reactiv

2、e oxygen species,ROS）誘導的氧化應激被證實在HSC的激活、轉(zhuǎn)化及肝纖維化發(fā)病及進展中具有十分重要的作用。
　　我們前期研發(fā)現(xiàn)中藥單體熊果酸能夠顯著抑制細胞因子瘦素、AngII及PDGF誘導的活化型HSCs內(nèi)NOX亞基的表達、NOX活性、NOX來源的ROS產(chǎn)生及其NOX下游PI3K/Akt、p38MAPK信號通路的激活，從而抑制活化型HSCs的增殖、并誘導其凋亡，發(fā)揮抗肝纖維化作用。那么熊果酸干預是否也能夠通過下

3、調(diào)NOX的表達而抑制靜止型HSC的活化，早期預防肝纖維化的發(fā)生，目前尚未闡明。本課題將繼續(xù)在前期研究的基礎上，以健康大鼠原代靜止型肝星狀細胞為研究對象，以TGF-β為促 HSC活化因子，探討熊果酸對靜止型HSC活化過程中NOX亞基表達的影響及該影響與靜止型HSC激活、轉(zhuǎn)化之間的關系，進一步探討熊果酸抗肝纖維化的作用機制。
　　目的：
　　探討熊果酸對大鼠靜止型HSC活化過程中NOX亞基表達的影響，及該影響與靜止型HSC激活、

4、轉(zhuǎn)化之間的關系。
　　方法：
　　采用肝臟原位灌注及密度梯度離心法從健康SD大鼠體內(nèi)分離提取原代靜止型HSCs，待原代HSCs自然培養(yǎng)至第5天時將細胞隨機分成五組并加用不同藥物進行處理：空白對照組（control組，細胞自然培養(yǎng)活化），熊果酸組（UA組，40μM），TGF-β組（5μg/L），熊果酸干預組（UA+TGF-β組，UA40μM+TGF-β5μg/L），DPI干預組（DPI+TGF-Β組，DPI10μM+ TGF-

5、β5μg/L）。原代HSCs經(jīng)加藥處理24h后提取細胞總蛋白，Western blot檢測NOX亞基gp91phox、p22phox、p67phox及HSC活化特異性標志物α-SMA的蛋白表達水平。藥物作用12h后采用RT-qPCR檢測NOX亞基Rac1、p22phox及I型膠原的mRNA表達。
　　結果：
　　1熊果酸對靜止型HSC活化過程中NOX亞基蛋白表達的影響
　　1.1 熊果酸對靜止型HSC活化過程中gp91

6、phox蛋白表達的影響
　　TGF-β刺激原代HSCs24h后gp91phox蛋白水平明顯高于空白對照組（P<0.01）；熊果酸組NOX亞基gp91phox蛋白表達明顯低于空白對照組（P<0.05）；在TGF-β刺激原代HSCs之前加入熊果酸進行干預后gp91phox蛋白水平較單純TGF-β刺激組顯著降低（P<0.01），并且與NOX抑制劑DPI干預組相比gp91phox蛋白的表達無統(tǒng)計學差異（P>0.05）。上述實驗結果表明，靜

7、止型HSC活化過程中gp91phox蛋白表達明顯升高，而熊果酸干預能夠抑制靜止型HSC活化過程中NOX亞基gp91phox的蛋白表達。
　　1.2 熊果酸對靜止型HSC活化過程中p67phox蛋白表達的影響
　　原代HSCs經(jīng)TGF-β刺激24h后NOX亞基p67phox蛋白表達顯著高于空白對照組（P<0.01）；熊果酸組p67phox蛋白表達則明顯低于空白對照組（P<0.05）；用TGF-β刺激原代 HSCs之前加入熊果酸

8、進行干預后p67phox蛋白水平較單純TGF-β刺激組顯著降低（P<0.01），其與NOX抑制劑DPI干預組相比p67phox蛋白的表達無統(tǒng)計學差異（P>0.05）。上述結果表明，靜止型HSC活化過程中p67phox蛋白表達明顯升高，而熊果酸干預能夠有效抑制靜止型HSC活化過程中NOX亞基p67phox的蛋白表達。
　　1.3 熊果酸對靜止型HSC活化過程中p22phox蛋白表達的影響
　　TGF-β刺激原代HSCs24h后

9、細胞內(nèi)p22phox的蛋白表達明顯高于空白對照組（P<0.01）；熊果酸組p22phox蛋白表達明顯低于空白對照組（P<0.05）；TGF-β作用于原代HSCs前使用熊果酸干預使細胞內(nèi)p22phox蛋白水平較單純TGF-β刺激組均顯著降低（P<0.01），且與DPI干預組相比無明顯統(tǒng)計學差異（P>0.05）。上述結果表明，靜止型HSC活化過程中p22phox蛋白表達水平明顯升高，而熊果酸干預能夠有效抑制靜止型HSC活化過程中NOX亞基p

10、22phox的蛋白表達。
　　2.熊果酸對靜止型HSC活化過程中NOX亞基mRNA表達的影響
　　2.1 熊果酸對靜止型HSC活化過程中Rac1mRNA表達的影響
　　用TGF-β刺激原代HSCs12h后細胞內(nèi)Rac1mRNA表達明顯高于空白對照組（P<0.01）；熊果酸組原代HSCs內(nèi)Rac1 mRNA表達則顯著低于空白對照組（P<0.05）；在TGF-β刺激原代HSCs前分別給予熊果酸、DPI干預后Rac1 mRN

11、A表達較單純TGF-β組均明顯降低（均P<0.05），且該兩組間Rac1 mRNA表達統(tǒng)計學差異不明顯（P>0.05）。上述結果表明，靜止型HSC活化過程中Rac1 mRNA表達水平明顯升高，而熊果酸干預能夠有效抑制靜止型HSC活化過程中NOX亞基Rac1的mRNA表達。
　　2.2 熊果酸對靜止型HSC活化過程中p22phox mRNA表達的影響
　　TGF-β刺激組原代HSCs內(nèi)p22phox mRNA表達明顯高于空白對

12、照組（P<0.01）；熊果酸組p22phox mRNA表達則明顯低于空白對照組（P<0.01）；在TGF-β刺激前給予熊果酸干預p22phox mRNA表達較單純TGF-β組明顯降低（P<0.01），且其效果與NOX抑制劑DPI干預組無明顯差異（P>0.05）。上述結果表明，靜止型HSC活化過程中p22phox mRNA表達水平明顯升高，而熊果酸干預能夠有效抑制靜止型HSC活化過程中NOX亞基p22phox的mRNA表達。
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13、.熊果酸對靜止型HSC活化過程中α-SMA蛋白表達的影響
　　原代HSCs經(jīng)TGF-β刺激24h后α-SMA蛋白表達明高于空白對照組（P<0.05）；熊果酸作用于自然培養(yǎng)的原代HSCs后α-SMA蛋白表達水平較空白對照組明顯降低（P<0.05）；在TGF-β刺激前分別使用熊果酸、NOX抑制劑DPI進行干預后α-SMA蛋白的表達較單純TGF-β刺激組均顯著下降（均P<0.01），較空白對照也均明顯下降（均P<0.05），且兩組間α-

14、SMA的表達無明顯統(tǒng)計學差異（P>0.05）。上述結果表明，NOX參與誘導HSC的活化，熊果酸干預能夠有效降低靜止型HSC活化過程中α-SMA的蛋白表達，抑制靜止型HSC的活化。
　　4.熊果酸對靜止型HSC活化過程中I型膠原mRNA表達的影響
　　TGF-β刺激原代HSCs12h后I型膠原mRNA表達則明顯高于空白對照組（P<0.05）；熊果酸組 I型膠原mRNA表達明顯低于空白對照組（P<0.05）；在TGF-β刺激前分

15、別給予熊果酸、DPI干預后I型膠原mRNA表達較單純TGF-β刺激組均明顯降低（均 P<0.01），兩組間 I型膠原mRNA表達無明顯差異（P>0.05）。上述結果表明，NOX參與調(diào)控HSC合成I型膠原，熊果酸干預能夠有效降低靜止型HSC活化過程中I型膠原的mRNA表達。
　　結論：
　　1．在靜止型HSC活化過程中NOX亞基gp91phox、p67phox、p22phox、Rac1的蛋白及mRNA表達明顯升高，熊果酸干預能