抗豬瘟卵黃抗體的制備及噴霧干燥.pdf

1、豬瘟是危害養(yǎng)豬業(yè)的重要疾病。特異性抗體具有較好的治療效果，但從動(dòng)物分離高免血清或制備單克隆抗體價(jià)格高、產(chǎn)量低，不適合大量生產(chǎn);而卵黃抗體(IgY)來(lái)源廣、成本低，適合大規(guī)模生產(chǎn)。近年來(lái)關(guān)于IgY的研究越來(lái)越多，其在疾病防治方面收到好的效果。本試驗(yàn)主要探討抗豬瘟卵黃抗體的制備，卵黃抗體ELISA檢測(cè)方法的建立，同時(shí)研究卵黃抗體噴霧干燥工藝及其保護(hù)劑。
　　方法:
　　1.抗豬瘟卵黃抗體ELISA檢測(cè)方法的建立
　　(1)

2、采用豬瘟疫苗病毒包被酶標(biāo)板，經(jīng)氯仿提取的陰、陽(yáng)性卵黃抗體作為一抗，用方陣滴定法進(jìn)行抗原最佳包被濃度、酶標(biāo)二抗工作濃度的確定;比較P/N值，確定各步孵育時(shí)間。(2)選取未免疫豬瘟疫苗的雞蛋30枚，氯仿法提取抗體，測(cè)其OD值，依據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)算陰陽(yáng)臨界值;用已知效價(jià)的卵黃抗體經(jīng)IHA和已建立的ELISA方法進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)，比較兩種方法的敏感性;選取禽流感、新城疫、豬腹瀉二聯(lián)苗陽(yáng)性卵黃抗體，同時(shí)以豬瘟陽(yáng)性與陰性血清抗體作為對(duì)照，檢測(cè)ELISA方

3、法的特異性;檢測(cè)建立的ELISA方法的重復(fù)性。
　　2.豬瘟卵黃抗體的制備及品質(zhì)檢測(cè)
　　(1)選取200日齡健康海蘭灰蛋雞50只，用滅活豬瘟疫苗胸部肌肉分點(diǎn)注射，取免疫后不同天數(shù)的雞蛋提取卵黃抗體。用已建立的ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)，當(dāng)效價(jià)下降到一半時(shí)，進(jìn)行下一次免疫。收集效價(jià)達(dá)到1∶4096的雞蛋，用水稀釋法提取卵黃抗體。(2)將提取的卵黃抗體接種普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂和厭氧肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h，觀(guān)察細(xì)菌生長(zhǎng)情況。動(dòng)物安全

4、性試驗(yàn)，將提取的卵黃抗體給小鼠和雛雞注射，觀(guān)察動(dòng)物精神狀態(tài)，72h后剖檢，觀(guān)察心、肝、脾、肺、腎等器官有無(wú)病理變化。
　　3.噴霧干燥保護(hù)劑的篩選及工藝研究
　　用葡萄糖、蔗糖、脫脂乳、乳糖、海藻糖分別做抗體保護(hù)劑，將提取的卵黃抗體進(jìn)行噴霧干燥。觀(guān)察上述物質(zhì)的濃度變化對(duì)抗體活性的保留水平的保護(hù)作用，對(duì)比五種糖在高溫下對(duì)抗體的保護(hù)水平。篩選最佳保護(hù)劑及保護(hù)濃度。設(shè)計(jì)入口溫度、進(jìn)料速度、糖濃度的3因素3水平正交試驗(yàn)，分析3因素對(duì)

5、抗體活性及出粉率兩個(gè)指標(biāo)的影響水平，選取最佳噴霧工藝。
　　試驗(yàn)結(jié)果如下:
　　1.(1)抗原最佳包被濃度為1∶1000，酶標(biāo)二抗工作濃度為1∶6000，一抗稀釋至1∶1024時(shí)，陽(yáng)性值在1.000左右，且相鄰孔的OD值變化較大。其所對(duì)應(yīng)的陰性值小于0.2，且P/N值最大。實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化結(jié)果:2％的明膠37℃封閉30min，一抗和二抗最佳孵育條件分別為37℃1h和45min，最佳顯色時(shí)間為室溫20min，OD450nm值接近

6、1，且P/N值較大。
　　(2)經(jīng)計(jì)算，30份豬瘟陰性卵黃抗體平均值(X)為:0.103，標(biāo)準(zhǔn)差(SD)為0.014。根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，OD450nm值≥0.145時(shí)，判定為陽(yáng)性;OD450nm值＜0.131時(shí)，判定為陰性;OD450nm值介于兩者之間為可疑。
　　豬瘟陽(yáng)性卵黃抗體經(jīng)IHA檢測(cè)效價(jià)為27。將此卵黃抗體用建立的間接ELISA方法檢測(cè)，抗體倍比稀釋至214后，仍能檢測(cè)出陽(yáng)性，表明建立的ELISA方法具有很高的靈敏性

7、。HI效價(jià)分別為26、29的H9亞型禽流感和新城疫的陽(yáng)性卵黃抗體及豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉二聯(lián)苗的陽(yáng)性卵黃抗體，同陰性豬瘟血清抗體檢測(cè)結(jié)果一致，其值均小于0.131，而陽(yáng)性豬瘟血清抗體值為1.112，表明該方法特異性較強(qiáng)。5份卵黃抗體分別經(jīng)同一批次制備的酶標(biāo)板和不同批次的酶標(biāo)板檢測(cè)，結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析變異系數(shù)均小于10％，表明具有良好的重復(fù)性。
　　2.(1)三免后抗體最高水平達(dá)1∶4096。四免后抗體最高水平達(dá)1∶8192，維

8、持時(shí)間約一個(gè)月。(2)水稀釋法提取的卵黃液黃色均勻，無(wú)特殊氣味，經(jīng)普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂和厭氧肉湯培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)24小時(shí)均無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng);注射后的雛雞及小鼠生長(zhǎng)良好，未見(jiàn)異常，剖檢未見(jiàn)內(nèi)臟器官有病理變化。
　　3.加入保護(hù)劑時(shí)，噴霧干燥后的抗體活性保留率較高（數(shù)值范圍），極顯著高于未加保護(hù)劑組的38.49％(P＜0.01)。對(duì)比五種保護(hù)劑同一添加濃度下對(duì)抗體活性保留效果:葡萄糖＞海藻糖＞蔗糖＞乳糖＞脫脂乳。
　　選取0.25％葡萄糖添加

9、濃度，進(jìn)行噴霧干燥工藝單因素試驗(yàn)分析:進(jìn)料速度對(duì)抗體活性無(wú)明顯影響，但對(duì)出粉率影響較大。進(jìn)料600-1300ml/h之間時(shí)，抗體活性保留均能維持在90％以上，出粉率在800ml/h時(shí)顯著下降為31.36％(P＜0.05)。入口溫度:抗體活性隨著入口溫度的增加而降低。在入口溫度70℃-120℃之間時(shí)活性保留均在92％以上，在入口溫度130℃-160℃時(shí)顯著降低(P＜0.05)。出粉率隨著溫度的升高而顯著性升高(P＜0.05)。
　　

10、正交試驗(yàn)結(jié)果:噴霧條件為150℃、500ml/h、0.25％時(shí)出粉最高，條件為70℃、700ml/h、0.06％時(shí)活性保留最高。出粉率影響因素:入口溫度(78.75)＞糖濃度(9.5)＞進(jìn)料速度(5.5)，且78.75＞19入口溫度的影響差異顯著?；钚苑治鲋?，3因素對(duì)活性保留影響F比均小于19，所以差異均不顯著。
　　結(jié)論:
　　1.成功建立了檢測(cè)豬瘟卵黃抗體的ELISA方法
　　試驗(yàn)表明，采用滅活豬瘟疫苗病毒包被酶標(biāo)

11、板，性質(zhì)穩(wěn)定。建立的方法敏感性高、特異性好、可重復(fù)性強(qiáng)。
　　2.成功制備了抗豬瘟卵黃抗體
　　通過(guò)給蛋雞多次注射豬瘟滅活苗，能夠獲得高效價(jià)卵黃抗體;提取的卵黃抗體經(jīng)驗(yàn)證安全、無(wú)菌，在經(jīng)10倍稀釋后依然能夠中和一頭份劑量的豬瘟疫苗。
　　3.建立優(yōu)化了卵黃抗體的噴霧干燥工藝
　　正交試驗(yàn)分析表明，3個(gè)水平的進(jìn)料速度和糖濃度對(duì)抗體活性和出粉率影響差異均不顯著。不同入口溫度對(duì)出粉率影響差異顯著(P＜0.05)，但對(duì)抗