RVG29修飾腦靶向納米藥物遞釋系統(tǒng)的研究.pdf

1、神經(jīng)退行性疾病(Neurodegenerative diseases)是一類(lèi)以腦部神經(jīng)元發(fā)生退行性病變?yōu)樘卣鞯穆约膊?，其臨床癥狀體現(xiàn)在運(yùn)動(dòng)或記憶方面的障礙，主要是由于負(fù)責(zé)相關(guān)功能的神經(jīng)元或其髓鞘發(fā)生缺失所導(dǎo)致的。常見(jiàn)的神經(jīng)退行性疾病包括帕金森病(Parkinson's disease，PD)和阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)等。神經(jīng)退行性疾病的主要特點(diǎn)是病程長(zhǎng)、進(jìn)展緩慢、神經(jīng)元一旦發(fā)生死亡無(wú)法再生以及疾病的

2、進(jìn)程不可逆轉(zhuǎn)。因此，實(shí)現(xiàn)神經(jīng)退行性疾病的早期診斷和治療至關(guān)重要。
　　在神經(jīng)退行性疾病的早期階段，腦部結(jié)構(gòu)和功能的變化并不明顯，需要依賴(lài)于特定的疾病標(biāo)記物分子的變化情況進(jìn)行診斷。近年來(lái)分子熒光探針已廣泛應(yīng)用于腫瘤等疾病的診斷成像研究，它的主要優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高，適用于疾病早期標(biāo)記物的檢測(cè)，因此本課題選擇分子熒光探針作為神經(jīng)退行性疾病的診斷策略?；蛩幬锾貏e是近年來(lái)研究較為深入的RNA干擾（RNA interfering，RNAi）藥物

3、，由于其治療的特異性強(qiáng)并且治療效果明顯，具有非常廣闊的臨床應(yīng)用前景。所以，本課題選擇基因治療作為神經(jīng)退行性疾病的主要治療手段。如何實(shí)現(xiàn)診斷和治療藥物的腦部遞送是本課題主要關(guān)注和重點(diǎn)解決的問(wèn)題。
　　血腦屏障（blood-brain barrier, BBB）主要是由腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞(braincapillary endothelial cells，BCECs)形成緊密連接組成的，主要存在于血液和中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central ne

4、rvous system，CNS)之間的屏障結(jié)構(gòu)。它的存在一方面起到神經(jīng)保護(hù)的作用，保證中樞神經(jīng)系統(tǒng)較少被外來(lái)物質(zhì)侵?jǐn)_，維持高度的穩(wěn)態(tài)，同時(shí)為腦內(nèi)輸送營(yíng)養(yǎng)物質(zhì);另一方面，BBB的致密結(jié)構(gòu)也阻礙了用于腦部疾病診斷和治療的藥物通過(guò)非侵入性給藥方式進(jìn)入腦內(nèi)。
　　本課題選用由狂犬病毒糖蛋白衍生的一段29個(gè)氨基酸序列的多肽(命名為RVG29)作為腦靶向分子，將其修飾于藥物遞釋系統(tǒng)中，利用RVG29與其BBB上受體結(jié)合介導(dǎo)的穿細(xì)胞作用，將藥

5、物從血液轉(zhuǎn)運(yùn)至腦部，實(shí)現(xiàn)腦靶向藥物遞釋。
　　實(shí)現(xiàn)有效的腦部藥物遞送除了選擇合適的腦靶向策略之外，對(duì)于藥物的遞釋載體系統(tǒng)的選擇和優(yōu)化也至關(guān)重要。聚左旋賴(lài)氨酸樹(shù)枝狀分子(Dendrigraft L-lysines，DGLs)是由賴(lài)氨酸單體聚合形成的具有樹(shù)枝狀結(jié)構(gòu)的高分子。由于賴(lài)氨酸單體之間利用肽鍵連接，所以DGLs在體內(nèi)可以被酶類(lèi)降解;與此同時(shí)，賴(lài)氨酸是組成生物體內(nèi)蛋白的基本氨基酸，所以DGLs在體內(nèi)免疫原型低，生物相容性高;DGL

6、s表面具有豐富的氨基，可以通過(guò)共價(jià)連接等方式，對(duì)其進(jìn)行多種功能化修飾。此外，DGLs表面豐富的氨基也可以通過(guò)靜電復(fù)合作用與基因藥物復(fù)合，作為基因遞釋載體。因此，本課題選擇DGLs作為診斷和治療藥物遞釋的載體。
　　本課題第一章中首先對(duì)RVG29多肽的腦靶向性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。將RVG29多肽通過(guò)雙功能聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)連接于研究應(yīng)用較為成熟的聚酰胺-胺樹(shù)枝狀分子表面，構(gòu)建了RVG29修飾的腦靶向藥

7、物遞釋系統(tǒng)，重點(diǎn)評(píng)價(jià)了其體內(nèi)外的腦靶向性，主要考察了其腦部基因遞釋的能力。
　　本課題第二章研究主要是針對(duì)在帕金森病早期階段的凋亡診斷。在此階段主要發(fā)生了由casapase-3激活誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡。為了提高熒光成像的對(duì)比度，引入了熒光能量共振轉(zhuǎn)移技術(shù)（fluorescence resonance energy transfer, FRET）技術(shù)。將熒光能量共振轉(zhuǎn)移熒光對(duì)（熒光分子和其淬滅劑）分別修飾于DGLs表面，利用可以被激活型

8、caspase-3特異性識(shí)別和剪切的多肽序列DEVD作為連接分子，通過(guò)caspase-3激活的發(fā)生與否來(lái)控制FRET效應(yīng)的開(kāi)啟或關(guān)閉，進(jìn)一步結(jié)合腦靶向多肽RVG29的修飾，構(gòu)建成為DGLs-RVG29-FRET納米器件，能夠?qū)崿F(xiàn)體內(nèi)激活型caspase-3特異性的響應(yīng)并進(jìn)行熒光成像，進(jìn)而可以進(jìn)行帕金森病的早期凋亡診斷。
　　本課題第三章研究構(gòu)建了DGLs-PEG-RVG29包載DNA的腦靶向基因遞釋系統(tǒng)。RVG29修飾的DGLs腦

9、靶向基因遞釋系統(tǒng)保留了聚酰胺-胺系統(tǒng)的腦靶向基因遞釋特性，同時(shí)給藥系統(tǒng)的生物安全性有所提高。
　　本課題第四章的研究中，將第三章中構(gòu)建的腦靶向基因遞釋系統(tǒng)應(yīng)用于帕金森病的治療。以下調(diào)腦內(nèi)的caspase-3水平作為治療靶點(diǎn)，因?yàn)閏aspase-3的激活不僅可以直接誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，還可以通過(guò)上調(diào)腦膠質(zhì)細(xì)胞中炎癥因子的水平，產(chǎn)生神經(jīng)細(xì)胞毒作用，間接引起神經(jīng)細(xì)胞的死亡。在魚(yú)藤酮誘導(dǎo)的帕金森病大鼠模型上，RVG29修飾的DGLs腦靶向基

10、因遞釋系統(tǒng)能夠高效的遞送干擾caspase-3表達(dá)的治療基因進(jìn)入腦內(nèi)。通過(guò)疾病早期多次給藥，降低caspase-3酶原的水平，減少caspase-3的激活。從行為學(xué)，免疫組化等指標(biāo)考察了RVG29修飾的DGLs腦靶向基因遞釋系統(tǒng)的在疾病動(dòng)物模型上的藥效。通過(guò)腦組織凋亡分析和腦中細(xì)胞炎癥水平的測(cè)定，闡述了產(chǎn)生治療效果的雙重作用機(jī)制。
　　在本課題第五章的研究中，針對(duì)阿爾茨海默病的兩個(gè)典型的病理特征，一是由于BACE1(beta-si

11、te APP-cleaving enzyme1)代謝途徑失調(diào)引發(fā)的淀粉樣蛋白（amyloid beta，Aβ）沉積;另一種是tau過(guò)度磷酸化代謝異常引起的細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)纖維纏結(jié)。BACE1的水平可以利用RNA干擾進(jìn)行基因藥物調(diào)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)一段6個(gè)氨基酸的D型肽可以抑制神經(jīng)纖維的纏結(jié)。利用DGLs的樹(shù)枝狀結(jié)構(gòu)，除了對(duì)其進(jìn)行基本的腦靶向修飾外，將具有治療作用的多肽也修飾其上，進(jìn)一步包載能夠特異性干擾BACE1表達(dá)的基因藥物，實(shí)現(xiàn)基因-多肽藥物向