雷公藤紅素抑制反式維甲酸引起的分化綜合征及信號轉(zhuǎn)導機制研究.pdf

1、急性早幼粒細胞白血病(acute promyelocytic leukeamia, APL)是急性髓性白血病的特殊亞型。早期APL的治療方案以葸環(huán)類藥物聯(lián)合阿糖胞苷為主,但其完全緩解率很低,且在治療過程中,常因并發(fā)性彌散性血管內(nèi)凝血或原發(fā)性纖維蛋白溶解引起嚴重出血,最終導致患者早期死亡。
　　 反式維甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)是APL治療效果顯著提高的里程碑式藥物。ATRA能誘導APL細胞分

2、化和凋亡,使APL患者得到有效治療,患者4-5年無疾病生存率達70-80％。目前,ATRA已成為治療APL的首選藥。但在ATRA治療APL過程中,約四分之一的患者會發(fā)生分化綜合征(differentiation syndrome,DS),這是一種能導致死亡的嚴重副作用,主要表現(xiàn)為呼吸窘迫,不明原因發(fā)熱,體重減輕,間質(zhì)性肺浸潤,胸腔或心包積液,高血壓和急性腎衰竭,其中肺浸潤最為常見。及早明確診斷DS和應用地塞米松等激素進行治療,可降低DS

3、的相關(guān)死亡率,但DS的早期明確診斷相當困難,而且由于激素的毒性大而不能常規(guī)使用以預防DS的發(fā)生。因此,揭示DS的發(fā)生機制,尋找有效預防或治療該綜合征的方法,成為目前亟待解決的一個重要課題,受到研究者的高度關(guān)注。
　　 DS臨床病理特征是微血管損傷,主要表現(xiàn)為水腫、出血、纖維蛋白滲出、白細胞浸潤等,顯示DS的類似炎癥的病理表現(xiàn)。應用地塞米松進行治療有效,亦佐證該綜合征具有炎癥性特征。但導致這種病理改變的機制尚未完全明確,目前的研究

4、普遍認為,該綜合征的發(fā)生,至少涉及三個環(huán)節(jié):首先是血管內(nèi)細胞聚集增加。APL細胞被ATRA誘導分化成熟過程中,其表面與細胞粘附、聚集相關(guān)的重要粘附分子,如細胞間粘附分子(intercellular adhesion molecular1,ICAM-1)表達升高,APL細胞間(自血病細胞/白血病細胞)相互粘附能力增加,導致細胞聚集,引起小血管血流變慢,甚至阻塞。其次是細胞出血管能力增加。APL細胞被ATRA誘導分化成熟后,表面粘附分子表達

5、增加,與血管內(nèi)皮細胞的粘附能力增加,助長其出血管;體內(nèi)外阻斷ICAM-1的表達,能減輕ATRA導致的白血病細胞粘附力與肺浸潤。最后是進入組織后的細胞炎癥反應能力增加。被ATRA誘導分化成熟后的APL細胞,能分泌引起炎癥反應的因子和酶,大量進入組織后,啟動類似炎癥的反應,能造成組織損傷。因此,阻斷上述環(huán)節(jié),如阻斷粘附分子的表達、抑制細胞釋放炎癥因子,被認為能用于治療DS。
　　 雷公藤系衛(wèi)矛科植物,長期以來作為治療風濕性關(guān)節(jié)炎等自

6、身免疫性疾病的藥物。雷公藤紅素是從雷公藤中提取的一種三萜類單體,有很強的抗炎癥作用。多種動物疾病模型證實,雷公藤紅素對膠原性關(guān)節(jié)炎、哮喘、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、阿爾茨海默病等有顯著的治療作用。細胞和分子生物學研究顯示,雷公藤紅素能抑制炎癥因子如TNF-α和IL-1β等的合成與釋放;阻斷炎癥因子與其靶結(jié)合引起的效應,如炎癥因子能引起內(nèi)皮細胞活化、表達ICAM-1, VCAM-1和E-selectin等粘附分子,而雷公藤紅素對此有強烈抑制作用。<

7、br>　　 本課題組在前期研究中用炎癥因子刺激原代培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞HUVEC建立炎癥反應模型,結(jié)果發(fā)現(xiàn),雷公藤紅素能阻斷炎癥因子導致的內(nèi)皮細胞表達粘附分子ICAM-1、VCAM-1和E-seleetin,并阻斷活化內(nèi)皮細胞與白細胞的粘附,其阻斷作用遠遠強于地塞米松、布洛芬等常用抗炎癥藥物。鑒于ATRA誘導引起的白血病細胞表面多種粘附分子的表達及多種炎癥因子的分泌,是DS肺浸潤的分子基礎,我們用急性早幼粒細胞白血病細胞系NB4為細

8、胞模型進行研究,發(fā)現(xiàn)雷公藤紅素能抑制ATRA導致的白血病細胞與內(nèi)皮細胞的粘附增加。
　　 基于上述結(jié)果,我們提出了雷公藤紅素治療DS的設想。本課題在證實雷公藤紅素不影響ATRA誘導細胞分化效果,但能抑制ATRA治療產(chǎn)生的致命副作用-分化綜合征的基礎上,深入分析了其作用的機制。
　　 一、雷公藤紅素抑制反式維甲酸引起的分化綜合征
　　 本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),雷公藤紅素能抑制ATRA導致的白血病細胞與內(nèi)皮細胞的粘附增

9、加,提示雷公藤紅素可能用于治療分化綜合征(DS)。但雷公藤紅素是否會干擾ATRA誘導APL細胞分化這一治療效果？本部分研究首先用細胞形態(tài)學、生化指標、分子標志等指標,觀察雷公藤紅素對NB4細胞分化成熟的影響。結(jié)果表明在細胞形態(tài)上,雷公藤紅素不影響ATRA導致的NB4細胞的胞漿量增多,細胞核出現(xiàn)核偏位,有些胞核由凹陷變?yōu)槟I形,甚至出現(xiàn)桿狀或分葉核等粒細胞系分化的形態(tài)學特征。在硝基藍四氮唑藍(NBT)還原功能上,雷公藤紅素能協(xié)同ATRA誘導

10、的NB4細胞的NBT還原反應能力。在調(diào)節(jié)分化抗原表達上,除了CD33外,雷公藤紅素對ATRA導致的NB4細胞膜表面分化抗原CD11b、CD13和CD15變化沒有影響。結(jié)果表明雷公藤紅素對ATRA導致APL細胞分化成熟的能力沒有影響。
　　 雷公藤紅素能抑制ATRA導致的白血病細胞與內(nèi)皮細胞的粘附,同時又不會影響ATRA誘導白血病細胞分化成熟。因此,雷公藤紅素能否作為治療DS的新藥物,值得進一步研究。我們按文獻構(gòu)建DS小鼠模型,將

11、體外誘導分化的NB4細胞尾靜脈注射入重癥免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠,再口服ATRA或者腹腔注射雷公藤紅素,組織化學檢測雷公藤紅素抑制ATRA誘導白血病細胞浸潤肺部的效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn),ATRA能引起細胞肺浸潤,這種細胞浸潤可被雷公藤紅素抑制。
　　 以上結(jié)果表明,雷公藤紅素不影響ATRA誘導NB4細胞分化成熟作用但在體內(nèi)能抑制ATRA誘導的肺浸潤。
　　 二、雷公藤紅素通過抑制反式維甲酸誘導ICAM-1表達而減輕分化綜

12、合征
　　 多種因素參與ATRA導致的細胞組織浸潤過程,但ATRA導致的細胞粘附增加,是引起分化綜合征早期細胞出血管浸潤組織的關(guān)鍵。ATRA誘導APL細胞分化過程中,分化的APL細胞表面表達大量與細胞粘附相關(guān)的分子,使得APL細胞易穿越血管而浸潤肺,結(jié)果導致超炎反應的發(fā)生。因此,我們猜想雷公藤紅素對DS的抑制作用,可能與其對細胞粘附分子的表達抑制有關(guān)。為了驗證該猜想,我們通過體內(nèi)外實驗,觀察了雷公藤紅素對ATRA誘導白血病細胞表

13、達粘附相關(guān)分子的影響。
　　 我們首先利用DS動物模型,并應用流式細胞術(shù),研究雷公藤紅素對DS外周血中白血病細胞粘附分子表達的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),DS小鼠外周血中的NB4細胞,其表面的粘附分子ICAM-1的表達增加,而用雷公藤紅素處理之后,這些粘附分子的表達受到抑制。這些結(jié)果提示,雷公藤紅素抑制ATRA誘導的肺浸潤,可能與其抑制ATRA導致的細胞粘附有關(guān)。為了進一步揭示雷公藤紅素抑制ATRA誘導的肺浸潤的機制,我們用NB4細胞為細胞

14、模型進行了探索。結(jié)果發(fā)現(xiàn),ATRA誘導之后,NB4細胞表面CD11a、CD11b、CD11c、CD49d等粘附分子的表達也同時發(fā)生上調(diào),但雷公藤紅素處理后,這些粘附分子的增加沒有受到抑制;對白細胞穿越血管發(fā)揮重要作用的VCAM-1和E-selectin不被ATRA誘導表達,雷公藤紅素對其的表達也沒有影響;但是,在DS早期中起重要作用的ICAM-1,其表達可被ATRA顯著誘導,而這種誘導可被雷公藤紅素顯著抑制。
　　 ATRA導致

15、的白血病細胞分泌的炎性因子和趨化因子,也是DS發(fā)生的重要分子基礎,雷公藤紅素對這些因子是否也有影響呢？因此,我們進一步檢測了雷公藤紅素對ATRA誘導NB4細胞分泌炎性因子和趨化因子的影響。結(jié)果顯示,ATRA誘導后,NB4細胞中炎性因子IL-1β和TNF-α、趨化因子MCP-1和IL-8的分泌明顯增加,雷公藤紅素處理后,MCP-1和IL-8的分泌并未受到影響,而IL-1β和TNF-α的分泌則明顯受到抑制。
　　 以上結(jié)果表明,在體

16、內(nèi),雷公藤紅素能抑制DS外周血中白血病細胞粘附分子的表達;在體外,雷公藤紅素能明顯抑制ATRA誘導的NB4細胞表達ICAM-1、抑制ATRA誘導NB4細胞分泌IL-β和TNF-α,但不能抑制ATRA誘導NB4細胞分泌MCP-1和IL-8。這些研究結(jié)果提示,雷公藤紅素對ATRA誘導細胞肺浸潤的抑制作用與其抑制ATRA誘導的ICAM-1表達增加有關(guān)。
　　 三、雷公藤紅素通過MEK-ERK抑制反式維甲酸誘導的ICAM-1的表達

17、>　　 多項研究表明,ICAM-1的表達增加是DS發(fā)生的重要分子因素之一。我們前面的結(jié)果表明,雷公藤紅素抑制ATRA誘導的肺浸潤,與其抑制ATRA誘導白血病細胞表達ICAM-1有關(guān)。但是,雷公藤紅素是通過什么途徑抑制ATRA誘導的ICAM-1呢？本研究部分采用小分子抑制劑結(jié)合Western方法,對目前已知的能調(diào)控ICAM-1誘導性表達的相關(guān)信號通路進行篩選,以明確雷公藤紅素抑制ATRA誘導NB4細胞表達ICAM-1的機制。
　　

18、 我們和其他研究組均發(fā)現(xiàn),雷公藤紅素是一種新型HSP90抑制劑。而HSP90能通過其結(jié)合的IKK,影響NF-kB的活性,從而調(diào)控ICAM-1的表達。因此,我們首先觀察在NB4細胞中,雷公藤紅素抑制ICAM-1的表達,是否與HSP90有關(guān)。我們用HSP90抑制劑17-AAG處理NB4細胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn),17-AAG的處理不但沒有抑制作用,反而能協(xié)同ATRA刺激NB4細胞表達ICAM-1。NF-κB是調(diào)控ICAM-1誘導性表達的重要轉(zhuǎn)錄因子,

19、而雷公藤紅素在多種細胞模型中顯示出對NF-κB強烈的抑制作用。因此,我們接著觀察了ATRA對NF-κB的活化作用及雷公藤紅素對該作用的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),ATRA能活化NB4細胞的NF-κB(p65),而雷公藤紅素對ATRA活化NF-κB有明顯的抑制作用。但是,用NF-κB抑制劑BAY11-7802和PDTC,并不能抑制ATRA導致的ICAM-1誘導性表達。此研究表明,雷公藤紅素對ATRA誘導的ICAM-1表達的抑制與NF-κB通路沒有直接

20、關(guān)聯(lián)。ICAM-1的誘導性表達也受JAK/STAT信號通路中的STAT1調(diào)控,而有文獻報道ATRA能活化NB4細胞中的STAT1。因此,我們也對此進行了驗證。結(jié)果顯示,ATRA能活化NB4細胞中的STAT1,且雷公藤紅素對該活化有抑制作用,但是,用STAT1抑制劑AG490,也同樣不能抑制ATRA導致的ICAM-1誘導性表達。
　　 MAPK信號通路也是調(diào)控ICAM-1誘導性表達的一個重要通路。文獻報道,ATRA對NB4細胞的M

21、APK信號通路的關(guān)鍵蛋白P38和ERK有活化作用。因此,我們首先檢測了ATRA對P38、JNK和ERK的活化情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn),ATRA誘導能引起p-P38和p-ERK的表達明顯上調(diào),而p-JNK的表達無明顯變化,而雷公藤紅素處理后,P38的活化不受影響,而ERK的活化受到抑制。那么,雷公藤紅素是否通過抑制ERK的活化,發(fā)揮其對ATRA誘導的ICAM-1表達的抑制作用呢？我們進一步用ERK抑制劑PD98059,對NB4細胞進行預處理后,再用

22、ATRA進行刺激。結(jié)果發(fā)現(xiàn),ERK抑制劑PD98059能抑制ATRA導致的ICAM-1表達增加。以上結(jié)果表明,紅素對ATRA誘導的ICAM-1表達的抑制作用與其對ERK的磷酸化抑制有關(guān)。那么,雷公藤紅素是如何影響ERK的活化呢？有文獻報道雷公藤紅素能與ERK直接結(jié)合。在本部分研究中,我們也對雷公藤紅素與ERK的結(jié)合進行計算機預測,發(fā)現(xiàn)雷公藤紅素的C6與ERK的C164-SH能形成化學鍵。另外,ERK的活化也受上游蛋白MEK的調(diào)控。因此,

23、為了證實雷公藤紅素是否是直接通過抑制ERK,影響ATRA誘導的ICAM-1的表達,我們觀察了ATRA對ERK的上游蛋白MEK的作用及雷公藤紅素的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),ATRA刺激NB4細胞15 min,就能誘導MEK發(fā)生磷酸化,60 min MEK的磷酸化水平達到高峰,而雷公藤紅素處理能明顯抑制ATRA導致的NB4細胞MEK的磷酸化。同樣,用MEK抑制劑U0126進行處理后,ATRA誘導的NB4細胞表達ICAM-1增加也受到了抑制。