siRNA靶向抑制CDCA5對人肝癌細(xì)胞HepG2增殖及凋亡影響的研究.pdf

1、研究背景：
　　我國是原發(fā)性肝癌的高發(fā)病率國家，全世界新發(fā)病率的55％發(fā)生在中國。每年我國總體發(fā)病率約26-32/10萬人，有些地區(qū)高達(dá)70-80/10萬人。肝癌死亡率極高，在所有惡性腫瘤中居第3位。肝癌起病隱匿，發(fā)病早期通常無特異性癥狀，極易轉(zhuǎn)移，就診時多為晚期，對放化療不敏感。因此，尋找手術(shù)及放化療之外新的治療方法顯得尤為重要。目前，基因治療已逐漸成為一種腫瘤治療的新策略。
　　細(xì)胞分裂周期相關(guān)蛋白5（cell divi

2、sion cycle associated5，CDCA5）屬于肝癌數(shù)量性狀位點（quantitative trait locus, QTL）區(qū)域基因，主要功能是保證姐妹染色單體在有絲分裂后期的準(zhǔn)確分離，對于維持基因組的完整性十分必要。最近研究結(jié)果表明，CDCA5基因表達(dá)上調(diào)與肺癌、宮頸癌及前列腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，且本課題組近期研究發(fā)現(xiàn)CDCA5基因在肝癌組織及肝癌細(xì)胞中高表達(dá)，并與肝癌的臨床病理特征呈正相關(guān)。因此，以CDCA5基因為

3、靶點的治療有望成為肝癌靶向治療的一個新方向。本研究采用小干擾RNA（small interfering RNA, siRNA）技術(shù)靶向抑制人肝癌細(xì)胞HepG2中CDCA5的表達(dá)，在體外水平研究靶向抑制CDCA5基因?qū)Ω伟┘?xì)胞的增殖和凋亡能力的影響，為肝癌基因治療的體內(nèi)研究奠定基礎(chǔ)。
　　研究目的：
　　研究siRNA靶向抑制CDCA5基因表達(dá)對人肝癌細(xì)胞株HepG2增殖及凋亡能力的影響。
　　研究方法：
　　1、

4、高表達(dá)CDCA5基因的人肝癌細(xì)胞株的篩選
　　采用免疫印跡法（Western blot）在蛋白水平上檢測3種肝癌細(xì)胞株 HepG2、Hep3B、Huh7和正常肝細(xì)胞株HL-7702中CDCA5蛋白的表達(dá)情況，從而篩選出高表達(dá)CDCA5蛋白的人癌細(xì)胞株進(jìn)行后續(xù)實驗。
　　2、CDCA5 siRNA的設(shè)計制備及肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化
　　設(shè)計制備抑制CDCA5基因的siRNA載體片段（序列1、2和3）:釆用熒光標(biāo)記的陰性對

5、照siRNA(FAM-siRNA)轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，以LipofectAmineTM RNAiMAX為媒介轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞株，用倒置熒光顯微鏡檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率，優(yōu)化最佳轉(zhuǎn)染條件。
　　3、siRNA靶向抑制CDCA5對人肝癌細(xì)胞HepG2增殖及凋亡的影響
　　將實驗分為5個組，分別為：A組（轉(zhuǎn)染siRNA序列1）、B組（轉(zhuǎn)染siRNA序列2）、C組（轉(zhuǎn)染siRNA序列3）、NC組（轉(zhuǎn)染通用陰性對照siRNA片段）和空白組（不

6、予任何處理）。通過Western blot檢測72h各組細(xì)胞CDCA5的表達(dá)水平；選擇合適的siRNA和LipofectAmineTM RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑濃度進(jìn)行下一步實驗。利用CCK-8法檢測24、48、72、96、120h各組細(xì)胞增殖能力；采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞48h的的凋亡水平。
　　研究結(jié)果：
　　1.成功篩選出高表達(dá)CDCA5基因的人肝癌細(xì)胞株：Hep G2細(xì)胞株。
　　2.當(dāng)siRNA終濃度為10nM

7、、LipofectAmineTM RNAiMAX1.75μl/ml時的siRNA轉(zhuǎn)染效率達(dá)90%以上。
　　3. A、B和C組的CDCA5蛋白水平均低于NC組和空白組（P＜0.05），其中B組的表達(dá)率最低，抑制率最高，達(dá)89.3％。
　　4.自轉(zhuǎn)染48h起，B組的相對增殖率均低于NC組和空白組（P＜0.05）；B組轉(zhuǎn)染72h的相對增殖率為（66.58±2.58）％，均低于其他觀察時間點（P＜0.05）。B組轉(zhuǎn)染48h的早期和