ERCC1、ERCC2在食管癌細胞株中的表達及與順鉑、紫杉醇敏感性相關(guān)研究.pdf

1、目的：ERCC1(excision repair cross complementing1)和ERCC2(excision repair cross complementing2)即核苷酸切除修復(fù)交叉互補基因1和2，兩者分別在DNA損傷修復(fù)中發(fā)揮受損DNA 5’端外切和雙鏈解螺旋作用。大量文獻和臨床資料已經(jīng)證實兩者表達水平上調(diào)是鉑類化療藥物耐藥的重要分子基礎(chǔ)。同時有資料顯示ERCC2蛋白水平與抗有絲分裂劑紫杉醇敏感性呈顯著負相關(guān)。尚無其

2、mRNA水平與紫杉醇敏感性相關(guān)報道。順鉑和紫杉醇為經(jīng)典化療藥物，在食管癌化療中起著舉足輕重的作用，但化療并非對所有患者都有效。如何篩選出化療敏感個體，減少陪療人群，實現(xiàn)個體化化療是目前研究熱點。本研究通過測定6株常見食管鱗癌細胞株中ERCC1和ERCC2 mRNA水平表達，比較其表達水平與順鉑、紫杉醇藥物敏感性的關(guān)系。并進一步研究了siRNA下調(diào)ERCC2表達后順鉑和紫杉醇敏感性的變化。以求在食管癌細胞株中證實ERCC1和ERCC2 m

3、RNA水平與順鉑敏感性的關(guān)系，及探討ERCC2 mRNA表達與紫杉醇敏感性的相關(guān)性。為臨床篩選敏感個體和敏感藥物，實現(xiàn)個體化化療提供資料。 方法： 第一部分 1.培養(yǎng)國內(nèi)常用食管鱗癌細胞株6株。RT-PCR法測定各細胞株ERCC1、ERCC2 mRNA表達及其表達相關(guān)性。 2.MTT法測定濃度梯度的順鉑、紫杉醇作用24h后的IC50值(抑制率50％時的藥物濃度)。比較兩因子mRNA水平與順鉑、紫杉醇IC5

4、0值的相關(guān)性。 第二部分 1.應(yīng)用體外合成靶向ERCC2的siRNA(si-ERCC2)，脂質(zhì)體法瞬時轉(zhuǎn)染ERCC2高表達細胞株KYSE150。同時設(shè)陰性對照、脂質(zhì)體對照和空白對照組。RT-PCR和流式細胞術(shù)(FCM)分別檢測各轉(zhuǎn)染組細胞ERCC2 mRNA和蛋白水平的表達。 2.MTT法檢測各轉(zhuǎn)染組細胞濃度梯度順鉑和紫杉醇的抑制率，計算IC50值。比較轉(zhuǎn)染前后順鉑和紫杉醇IC50值的變化。 結(jié)果：

5、 第一部分 1.ERCC1和ERCC2 mRNA表達情況ERCC1表達：6株細胞均可測出ERCC1特異性條帶，相對表達量在0.8214～0.1709間不等。表達最高的Eca109和最低的TE10表達量相差4.81倍。ERCC2表達：TE13未測出ERCC2條帶，為不表達ERCC2細胞株。余5株細胞可測出ERCC2表達。以KYSE150表達量最高，為0.8712。余4株細胞表達量在0.0870～0.2033間不等。與表達最高的K

6、YSE150表達量相差4～10倍。ERCC1和ERCC2表達相關(guān)系數(shù)Rs=0.258，P=0.076>0.05。兩因子表達存在相關(guān)趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)意義。 2.濃度梯度順鉑和紫杉醇作用24h后各細胞株IC50值及與ERCC1和ERCC2 mRNA表達的相關(guān)性順鉑IC50值在15.17±2.11ug/ml到42.84±3.82ug/ml間不等。其中KYSE150最高，TE13最低。兩者相差2.82倍。 紫杉醇IC50值在3.

7、44±1.05ug/ml到12.85±2.17ug/ml間不等。其中KYSE150最高，TE1最低。兩者相差3.74倍。 ERCC1 mRNA水平與順鉑IC50值相關(guān)系數(shù)Rs=0.835，P<0.01。呈明顯正相關(guān)。ERCC1 mRNA表達水平越高，順鉑IC50值越高，順鉑敏感性越低。 ERCC2 mRNA水平與順鉑IC50值相關(guān)系數(shù)Rs=0.379，P<0.01。呈明顯正相關(guān)。ERCC2 mRNA表達水平越高，順鉑IC

8、50值越高，順鉑敏感性越低。 ERCC1 mRNA水平與紫杉醇IC50值相關(guān)系數(shù)Rs=0.180，P>0.05。兩者之間無明顯相關(guān)性。 ERCC2 mRNA水平與紫杉醇IC50值相關(guān)系數(shù)Rs=0.293，P<0.05。呈明顯正相關(guān)。ERCC2 mRNA表達水平越高，紫杉醇IC50值越高，紫杉醇敏感性越低。 第二部分 1.siRNA轉(zhuǎn)染KYSE150后ERCC2 mRNA及蛋白水平表達轉(zhuǎn)染后ERCC2 mR

9、NA水平表達：si-ERCC2組在轉(zhuǎn)染后24、48、72h于相應(yīng)部位均未測出ERCC2特異性條帶。而三組對照三個時段均可見特異性條帶，表達量間無明顯差別(P>0.05)。說明si-ERCC2成功封閉了目的基因mRNA水平的表達。而三組對照對目的基因無干擾作用。 轉(zhuǎn)染后ERCC2蛋白水平表達：si-ERCC2組轉(zhuǎn)染24、48、72h后ERCC2蛋白表達量分別為0.688±0.11，0.484±0.09和0.400±0.04。較對照

10、組分別下調(diào)31.2％，51.6％和60.0％。而三組對照表達量無明顯差別(P>0.05)。表明si-ERCC2成功下調(diào)了目的基因蛋白水平的表達，而三組對照對其無下調(diào)作用。 2.siRNA轉(zhuǎn)染KYSE150后順鉑和紫杉醇IC50值的變化si-ERCC2組順鉑IC50值為26.41±2.63ug/ml，較對照組40.32±3.44ug/ml降低34％。紫杉醇IC50值為6.32±0.87ug/ml，較對照組的12.66±1.69ug

11、/ml降低49％。明顯低于三組對照(P<0.01)。說明下調(diào)ERCC2表達降低了順鉑和紫杉醇IC50值，增加了兩藥敏感性。 結(jié)論： 1.所測食管癌細胞株ERCC1、ERCC2有不同程度表達。 2.ERCC1和ERCC2 mRNA水平均與順鉑敏感性呈負相關(guān)，ERCC2 mRNA水平與紫杉醇敏感性呈負相關(guān)。ERCC1mRNA水平與紫杉醇敏感性無關(guān)。 3.轉(zhuǎn)染siRNA成功下調(diào)了ERCC2 mRNA和蛋白水平的