MicroRNA-296對腦缺血梗死后血管新生的調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、背景與目的:側(cè)枝循環(huán)的建立是改善腦梗死后腦組織血流供應(yīng)的有效途徑，治療性血管生成為缺血性腦卒中血運(yùn)重建提供了一種新的治療策略。微小RNA(microRNA，miRNA)是近年發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性非編碼小分子RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控細(xì)胞增殖分化、凋亡、分裂及器官的發(fā)育，與人類生命活動的多種疾病密切相關(guān)，已成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。在腦腫瘤實(shí)體及體外實(shí)驗中已證實(shí)miR-296通過直接抑制其靶基因HGS表達(dá)，呈現(xiàn)出促進(jìn)血管新生的作用。本研究體內(nèi)實(shí)驗

2、擬通過構(gòu)建大鼠大腦中動脈閉塞(middle cerebral arteryocclusion，MCAO)腦缺血梗死模型，檢測缺血梗死后腦組織中miR-296及其靶基因HGS的表達(dá)變化，同時動態(tài)觀察腦缺血梗死后血管新生的變化，初步明確miR-296是否參與腦缺血梗死后血管新生過程;進(jìn)一步在體外環(huán)境下培育人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical veinendothelial cell，HUVEC)，利用重組腺病毒技術(shù)過表達(dá)miR-

3、296于HUVEC內(nèi)，觀察血管內(nèi)皮細(xì)胞中HGS及VEGF-Notch通路相關(guān)分子VEGF、VEGFR2、DLL4和Notch1的mRNA及蛋白表達(dá)水平的變化，明確miR-296對VEGF-Notch信號通路的調(diào)控作用，深入探討闡明miR-296參與調(diào)控腦缺血梗死后血管新生的分子機(jī)制，為缺血性腦卒中治療提供新的靶點(diǎn)。
　　研究內(nèi)容與方法:
　　1.體內(nèi)實(shí)驗
　　1.1.構(gòu)建大鼠MCAO模型，行TTC染色以鑒定腦缺血梗死區(qū)

4、域。于缺血梗死后第1天，第3天，第7天留取腦組織標(biāo)本行相關(guān)檢測。
　　1.2.采用qRT-PCR方法檢測腦缺血梗死后不同時間點(diǎn)大鼠缺血腦皮質(zhì)區(qū)miR-296的表達(dá)水平，明確腦缺血梗死后miR-296動態(tài)表達(dá)變化。
　　1.3.采用Western blot法檢測腦缺血梗死后不同時間點(diǎn)大鼠缺血腦皮質(zhì)區(qū)HGS的蛋白表達(dá)，明確腦缺血梗死后miR-296的靶基因HGS的蛋白表達(dá)變化。
　　1.4.采用免疫組化染色法檢測腦缺血梗死

5、后不同時間點(diǎn)缺血腦皮質(zhì)區(qū)CD105標(biāo)記的新生微血管以判斷血管新生的情況。
　　2.體外實(shí)驗
　　2.1.采用貼壁法培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC-12。構(gòu)建腺病毒載體，將包裝AdV-miR-296-GFP及AdV-GFP的重組腺病毒分別轉(zhuǎn)染至HUVEC-12;熒光顯微鏡下觀察GFP綠色熒光的陽性率。實(shí)驗分為miR-296過表達(dá)組(AdV-miR-296-GFP)和對照組(AdV-GFP)。
　　2.2.行內(nèi)皮細(xì)胞小管形

6、成實(shí)驗，比較miR-296過表達(dá)組與對照組內(nèi)皮細(xì)胞血管形成數(shù)，明確miR-296對血管內(nèi)皮細(xì)胞血管形成能力的影響。
　　2.3.采用qRT-PCR法比較miR-296過表達(dá)組與對照組中miR-296的表達(dá)水平，以明確AdV-miR-296-GFP上調(diào)miR-296表達(dá)的水平。
　　2.4.采用RT-PCR、Western Blot法分別比較miR-296過表達(dá)組與對照組中HGS及VEGF-Notch信號通路相關(guān)分子VEGF、

7、VEGFR2、DLL4、Notch1的mRNA和蛋白表達(dá)水平，明確miR-296對VEGF-Notch信號通路的調(diào)控途徑。
　　結(jié)果:
　　1.體內(nèi)實(shí)驗
　　1.1.成功構(gòu)建大鼠MCAO模型。TTC染色可見左側(cè)大腦中動脈供血區(qū)的梗死灶呈白色，正常腦組織呈紅色。
　　1.2.qRT-PCR結(jié)果顯示，假手術(shù)組腦組織中可見miR-296的表達(dá)，腦缺血梗死后各時間點(diǎn)實(shí)驗組大鼠缺血腦皮質(zhì)區(qū)miR-296表達(dá)均高于假手術(shù)組（

8、各P＜0.05），miR-296在腦缺血梗死后第1天表達(dá)即開始上調(diào)(2.25±0.36)，第三天表達(dá)量繼續(xù)上調(diào)(5.35±0.35)，7天時最明顯(7.91±0.21)，表明正常非缺血梗死腦組織中存在miR-296的表達(dá)，且腦缺血損傷可刺激miR-296表達(dá)水平的逐漸上調(diào)。
　　1.3.Western blot結(jié)果顯示檢測腦缺血梗死后1d，3d，7d實(shí)驗組大鼠缺血腦皮質(zhì)區(qū)HGS的蛋白表達(dá)逐漸下降，驗證了腦缺血梗死后過表達(dá)的miR-

9、296可抑制其靶基因HGS的蛋白表達(dá)。
　　1.4.免疫組化染色結(jié)果顯示，腦缺血梗死后第一天即出現(xiàn)CD105陽性細(xì)胞(1.8±0.84)，第3天時陽性細(xì)胞數(shù)增多(6.8±2.17)，第7天可見更多的新生血管(10±2.17)，與miR-296表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.95，P＜0.05)，提示miR-296促進(jìn)腦缺血梗死后血管新生過程。
　　2.體外實(shí)驗
　　2.1.成功構(gòu)建腺病毒載體，將包裝AdV-miR-296-G

10、FP及AdV-GFP的重組腺病毒轉(zhuǎn)染至HUVEC-12細(xì)胞，熒光顯微鏡下可見絕大部分細(xì)胞均表達(dá)GFP綠色熒光，GFP陽性細(xì)胞率達(dá)90％以上。
　　2.2.qRT-PCR結(jié)果顯示，與對照組比較，miR-296過表達(dá)組miR-296上調(diào)了320±30倍。
　　2.3.內(nèi)皮細(xì)胞小管形成實(shí)驗結(jié)果顯示，與對照組比較，miR-296過表達(dá)組HUVEC-12細(xì)胞形成血管管腔數(shù)明顯增多(28±1.5 vs.8±2.5，P＜0.05)，表明m

11、iR-296可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞形成管腔樣結(jié)構(gòu)。
　　2.4.RT-PCR、western blot結(jié)果顯示，與對照組比較，miR-296過表達(dá)組HUVEC-12細(xì)胞中HGS mRNA的表達(dá)水平下降，其蛋白水平則顯著下降。與此同時，VEGF、VEGFR2的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著上調(diào)而DLL4、Notch1的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著下降(各P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.大鼠正常（非梗死）腦組織中存在miR