中國大鯢種質(zhì)資源保護的分子遺傳學(xué)研究.pdf

1、中國大鯢是我國特有的珍稀物種，為水生魚類演化到陸生爬行類的過渡類型。由于人為過度捕殺，生境破壞，以及自身繁殖率低等因素，造成其自然種群數(shù)量銳減，并處于極度瀕危狀態(tài)，已被我國列為國家二級保護動物。為恢復(fù)中國大鯢資源，目前已廣泛開展人工養(yǎng)殖，但由于親本過少，養(yǎng)殖模式不合理，容易引起近交衰退。本研究通過cDNA文庫構(gòu)建和篩選、隨機擴增多態(tài)DNA（RAPD），擴增片段長度多態(tài)（AFLP）、線粒體DNA（mtDNA）序列分析等技術(shù)，從種質(zhì)資源保存

2、和評價兩個層面進行中國大鯢種質(zhì)資源保護研究。通過保存中國大鯢種群遺傳信息，評價自然種群及養(yǎng)殖群體的種質(zhì)狀況，為中國大鯢資源的保護和可持續(xù)利用提供科學(xué)依據(jù)。主要研究結(jié)果如下： 1.中國大鯢腦組織cDNA文庫構(gòu)建。 本文以中國大鯢腦組織為材料，提取總RNA，應(yīng)用CloneminerTM文庫構(gòu)建技術(shù)構(gòu)建了cDNA文庫。經(jīng)檢測，文庫初始滴度為5×105 cfu/mL，重組率為91.70％，插入片斷大小在0.35～3.9 kb，平

3、均插入片段大小為0.791 kb，文庫擴增后滴度為4.0×109 cfu/mL。隨機挑選200個陽性克隆測序，經(jīng)生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)20個片段與已報道的基因有較高同源性，包括促甲狀腺激素基因、生長激素（Growth hormone，GH）基因及催乳素（Prolactin，PRL）基因等。 2.GH和PRL組織分布及系統(tǒng)發(fā)育應(yīng)用分析。 采用半定量RT—PCR方法分析了GH和PRL基因在成體中國大鯢各組織中的mRNA表達情況

4、，結(jié)果表明：GH，PRL只在垂體中檢測到表達；這與其他魚類和哺乳類的研究結(jié)果相一致。基于GH和PRL cDNA序列與氨基酸序列構(gòu)建的兩棲類系統(tǒng)發(fā)育樹能夠反映中度遠源的兩棲類真實發(fā)育關(guān)系。該基因家族的兩個基因可以得到較為一致的樹型，具有相近的系統(tǒng)發(fā)育分析能力。對功能基因數(shù)據(jù)源的進一步比較發(fā)現(xiàn)，核苷酸編碼區(qū)前兩個密碼子序列與氨基酸序列在解決較遠的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系時均具有相似價值，但是在MP法分析時，核苷酸序列略微優(yōu)于氨基酸序列。GH在解決有尾目

5、分類時，NJ樹與MP樹結(jié)果與傳統(tǒng)的有尾目分類關(guān)系一致。 3.采用AFLP標記及線粒體控制區(qū)序列分析方法對中國大鯢野生種群的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)進行分析。 AFLP標記被用于檢測5個自然種群的遺傳多樣性。采用9對引物組合對60個個體共擴增出501條帶，其中多態(tài)性條帶354（69.82％）；中國大鯢高水平的遺傳多樣性符合其生活史特征及地理分布，顯示作為一種古老物種的強大的潛在適應(yīng)力。AMOVA分析表明中國大鯢遺傳多樣性絕大

6、部分位于種群內(nèi)（97.94％）。種群間遺傳分化較弱（Fst類似物θ=0.1368；φst=0.021，P<0.001）。種群間遺傳距離（φst）和地理距離不相關(guān)（所有群體：r=0.1887，P=0.3150；長江流域群體：r=0.5336，P=0.3320）。聚類結(jié)果基本依照長江流域、黃河流域分為兩支?；趥€體距離的聚類結(jié)果顯示，多數(shù)黃河流域個體與長江流域個體聚為一支，存在一定的混亂。對8個種群15個個體線粒體控制區(qū)序列進行分析，在78

7、9 bp長的片段中共得到25個變異位點，定義10個單倍型。單倍型多態(tài)性和核苷酸多態(tài)性分別為0.895和0.960％，顯示控制區(qū)可以揭示中國大鯢豐富的遺傳多樣性水平。各單倍型間Kimura-2-parameter距離在0.001～0.022之間，平均為0.014，顯示分化較小。聚類結(jié)果大致可以分為黃河流域種群、長江流域種群及珠江流域種群，體現(xiàn)了與地理分布格局的統(tǒng)一性。但仍有個別個體聚類混亂。可能由于長期存在人為因素的干擾所致。結(jié)合遺傳結(jié)構(gòu)

8、結(jié)果及化石證據(jù)，推測中國大鯢種群的擴散途徑為由北至南。此外還將中國大鯢與近緣物種以及進化歷程相近的物種的遺傳多樣性進行比較，以期進一步闡明中國大鯢遺傳背景，為保護和利用這一珍稀古老物種的種質(zhì)資源提供理論依據(jù)。針對目前中國大鯢遺傳背景及保護現(xiàn)狀，對中國大鯢野生種群資源的保護提出建議。 4.利用隨機引物擴增多態(tài)DNA（RAPD）及擴增片段長度多態(tài)性（AFLP）標記對中國大鯢人工養(yǎng)殖四個世代群體進行了遺傳多樣性檢測。 本研究R

9、APD分析使用了20條隨機引物，共擴增出91個位點，多態(tài)位點比例為親代46.15％、子一代42.86％、子二代39.56％，子三代16.48％。中國大鯢世代群體的香農(nóng)信息指數(shù)（0.2787±0.0330、0.2556±0.0319、0.2301±0.0309、0.0644±0.0164）和基因多樣性指數(shù)（0.1935±0.0234、0.1759±0.0223、0.1573±0.0215、0.0401±0.0107）均呈逐代下降之勢，進一

10、步ANOVA分析顯示中國大鯢在繁育至子二代時差異并不顯著，到子三代時達到極顯著水平。AFLP方法使用九對引物組合，在中國大鯢四個世代群體60個樣品中共得到490個位點，其中多態(tài)位點數(shù)為291個，多態(tài)比例為59.39％。而中國大鯢親代、子一代、子二代和子三代群體多態(tài)位點比例分別為48.16％、44.69％、44.08％和32.24％，呈遞減趨勢。香農(nóng)信息指數(shù)（0.2775±0.0134、0.2539±0.0132、0.2481±0.013