DNA分子水平的“羅布麻”分類(lèi)、遺傳多樣性及種質(zhì)鑒定研究.pdf

1、本論文選取分布于中國(guó)各地有爭(zhēng)議的三個(gè)分類(lèi)群的“羅布麻”植物樣本作為實(shí)驗(yàn)材料，采用改進(jìn)Qiagen法從干燥和標(biāo)本葉片中提取到完整的基因組DNA，運(yùn)用ITS、tmL內(nèi)含子與trnL-F間隔區(qū)以及RAPD等分子標(biāo)記技術(shù)探討我國(guó)三種“羅布麻”的問(wèn)題和親緣關(guān)系：利用PCR產(chǎn)物直接測(cè)序法和RAPD-SCAR法分別對(duì)羅布麻及其易混品進(jìn)行分子鑒定；并對(duì)羅布麻和大葉白麻野生居群分別進(jìn)行RAPD遺傳多樣性分析。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下： 1.不同保存

2、狀態(tài)“羅布麻”葉片基因組DNA的提取參照從乙醇保存的動(dòng)物樣本中提取基因組DNA的方法，采用Qiagon植物基因組DNA提取試劑盒，并在核裂解之時(shí)加入木瓜蛋白水解酶37℃溫浴振蕩水解12小時(shí)，以去除蛋白質(zhì)釋放DNA，后續(xù)步驟按照Qiagen說(shuō)明書(shū)的方法。按照這一方法從不同生長(zhǎng)季節(jié)(取材時(shí)間從2005年7 月～2005年10月)與不同貯存方法(硅膠干燥、自然干燥與18年前的常規(guī)壓制標(biāo)本葉片)的三種“羅布麻”葉片中均提取出完整的基因組DNA。

3、 2.“羅布麻”的分類(lèi)問(wèn)題與親緣關(guān)系研究(1)測(cè)定了羅布麻、白麻和大葉白麻的核糖體DNA ITS序列、葉綠體trnL內(nèi)含子與trnL-F間隔區(qū)序列，并結(jié)合GenBank中相關(guān)屬種植物的ITS、tmL內(nèi)含子與trnL-F間隔區(qū)(含外類(lèi)群)對(duì)我國(guó)產(chǎn)“羅布麻”的系統(tǒng)分類(lèi)問(wèn)題進(jìn)行了分析。結(jié)果表明：羅布麻、白麻和大葉白麻都應(yīng)屬于羅布麻屬，而且它們之間的親緣關(guān)系較羅布麻屬內(nèi)其他植物種間的親緣關(guān)系更近。(2)對(duì)來(lái)源于9個(gè)省份的10個(gè)羅布麻居群

4、樣本和3個(gè)省份的5個(gè)大葉白麻居群樣本進(jìn)行RAPD-PCR檢測(cè)，分析羅布麻和大葉白麻種間和居群間的遺傳距離、相似度、多樣性指數(shù)，并進(jìn)行系統(tǒng)聚類(lèi)，結(jié)果顯示，羅布麻和大葉白麻的親緣關(guān)系超出了同一個(gè)種內(nèi)不同居群間的關(guān)系，應(yīng)為羅布麻屬(Apocynum)內(nèi)親緣關(guān)系較近的兩個(gè)種。 3.羅布麻及其近緣相似種的分子鑒定研究(1)利用PCR產(chǎn)物直接測(cè)序法對(duì)羅布麻及其易混品大葉白麻和(Apoacnum cannabinum)的核基因組(rDNA)I

5、TS區(qū)與葉綠體基因組(cpDNA)trnL內(nèi)含子及trnL-F間隔區(qū)序列進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果顯示:羅布麻和大葉白麻ITS序列完全一致，與A.cannabinum在ITS1區(qū)有13個(gè)位點(diǎn)、在ITS2區(qū)有10個(gè)位點(diǎn)不同；在trnL內(nèi)含子區(qū)及trnL-F間隔區(qū)，羅布麻和大葉白麻共有3個(gè)位點(diǎn)不同，羅布麻和A.cannabinum間共有23個(gè)位點(diǎn)、大葉白麻和A. cannabinum間共有20個(gè)位點(diǎn)不同。研究表明，依據(jù)ITS區(qū)序列可鑒別A.ca

6、nnabinum和國(guó)產(chǎn)“羅布麻”(羅布麻與大葉白麻)；利用trnL內(nèi)含子及trnL-F間隔區(qū)序列可鑒別羅布麻、大葉白麻和A.cannabinum。(2)用80條RAPD隨機(jī)引物對(duì)羅布麻和大葉白麻不同居群樣本擴(kuò)增，篩選出兩條羅布麻特異片段B08-407和B03.1368；片段經(jīng)克隆測(cè)序，并根據(jù)所測(cè)序列設(shè)計(jì)SCAR引物，其中B03-1368SCAR引物在退火溫度59℃時(shí)，將羅布麻和大葉白麻簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確鑒別開(kāi)來(lái)，將此SCAR標(biāo)記命名為SCB03

7、-1368。 4.羅布麻與大葉白麻野生居群遺傳多樣性分析(1)利用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)采自我國(guó)8個(gè)省份的9個(gè)羅布麻野生居群的遺傳多樣性進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，羅布麻具有較高的遺傳多樣性水平，遺傳分化主要發(fā)生在居群間。居群間遺傳距離與聚類(lèi)結(jié)果顯示各居群間的親緣關(guān)系與地理分布和環(huán)境特征有一定的相關(guān)性。根據(jù)引物B03產(chǎn)生的標(biāo)記識(shí)別碼可以有效鑒別羅布麻9個(gè)居群。(2)對(duì)分布于新疆、甘肅和青海三地的5個(gè)大葉白麻野生居群進(jìn)行RAPD遺傳多樣性