白藜蘆醇及一氧化氮抗心肌缺血-再灌注損傷保護作用的線粒體機制.pdf

1、第一部分：白藜蘆醇心肌保護作用的機制
　　急性心肌梗死（AMI）嚴重危害人類健康，在治療AMI過程中發(fā)生的缺血/再灌注損傷（IRI）目前還沒有理想的治療方法。最近的研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇能夠通過誘導藥物性預處理機制而保護再灌注心臟，其中一氧化氮（NO）、腺苷受體、磷脂酰肌醇（-3）激酶（PI3K）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）等細胞信號轉導途徑介導白藜蘆醇誘導的藥物性預處理心肌的保護機制。目前對心肌缺血/再灌注的研究中，糖原合成酶激

2、酶-3β（GSK-3β）和線粒體通透性轉移孔（mPTP）受到廣泛關注。在前期研究中發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇通過激活環(huán)磷酸鳥苷/蛋白激酶G（cGMP/PKG）信號通路，使 GSK-3β失活并誘導其向線粒體轉移，并與線粒體親和素D結合而抑制mPTP的開放，從而保護再灌注心臟。然而，白藜蘆醇激活cGMP/PKG信號途徑的具體機制尚不清楚。cGMP是一種重要的具有細胞內信息轉導作用的第二信使，而 PKG被認為是其最重要的下游信號。細胞內cGMP含量的調控

3、是由鳥苷酸環(huán)化酶（GC）介導的其合成作用及磷酸二酯酶（PDEs）催化的其水解作用來實現(xiàn)的。如果能增加 NO或抑制 PDE5活性，從理論上能夠增加細胞內 cGMP水平而激活cGMP/PKG信號通路。
　　本實驗利用 Langendorff裝置建立大鼠離體心臟缺血/再灌注損傷模型，采用心肌梗死面積測定、Ca2+誘導的線粒體腫脹實驗（mPTP開放實驗）、Western blotting蛋白分析、共聚焦顯微鏡觀察等方法，對白藜蘆醇的再灌注

4、心肌保護作用進行相關實驗研究，詳細探討PDE5在白藜蘆醇心肌保護中的作用及其機制。
　　實驗結果顯示，白藜蘆醇未能增加離體大鼠心肌細胞NO的水平，但明顯降低再灌注時PDE5的活性，并顯著增加再灌注時cGMP含量，表明白藜蘆醇的心肌保護作用并非通過鳥苷酸環(huán)化酶介導的cGMP生成，而是通過抑制PDE5活性而增加cGMP含量的途徑。而且白藜蘆醇明顯增加血管擴張刺激磷蛋白（VASP）及GSK-3β的磷酸化，此作用可被PKG抑制劑KT582

5、3所逆轉。另外，PDE的非選擇性抑制劑3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（IBMX）能夠模擬白藜蘆醇，明顯減少心肌梗死面積，并抑制mPTP的開放，此作用被mPTP開放劑Atractyloside所逆轉。這些結果證實，白藜蘆醇通過抑制PDE活性激活cGMP/PKG信號轉導通路，使GSK-3β失活，抑制mPTP的開放進而保護再灌注心臟。
　　小結：
　　1.白藜蘆醇明顯抑制大鼠離體再灌注心臟的PDE5活性而增加cGMP含量，并顯著增加V

6、ASP、GSK-3β的磷酸化。
　　2.非選擇性PDE抑制劑IBMX能夠模擬白藜蘆醇的心肌保護作用而減少心肌梗死面積，抑制mPTP開放。
　　3.白藜蘆醇通過抑制PDE5的活性而激活cGMP-PKG信號轉導通路，對缺血/再灌注心臟發(fā)揮保護作用。
　　第二部分：線粒體Src酪氨酸激酶及鋅在一氧化氮誘導的心肌缺血/再灌注損傷保護中的作用
　　一氧化氮（NO）誘導心肌保護作用的關鍵點在于其能夠抑制線粒體通透性轉移孔（m

7、PTP）的開放。但是，參與NO作用的線粒體信號轉導機制尚未明確。本研究的目的在于探討NO是否通過線粒體Src酪氨酸激酶及鋅而抑制氧化應激，進而發(fā)揮心肌缺血/再灌注損傷的保護作用。缺血前給予NO供體（SNAP），能夠明顯增加模擬缺血/再灌注大鼠心肌細胞的生存率，此作用被鋅離子螯合劑N,N,N′,N′-tetrakis-(2-pyridylmethyl)ethylenediamine（TPEN）和Src酪氨酸激酶抑制劑PP2所阻斷。SNAP

8、能夠抑制再灌注時線粒體膜電位（ΔΨm）的減少，此作用同樣被TPEN和PP2所阻斷。SNAP能夠增加再灌注時線粒體內游離鋅，并以鋅依賴性的方式增加線粒體Src的磷酸化。SNAP通過Src酪氨酸激酶及鋅抑制再灌注時線粒體復合體I的活性及線粒體活性氧（ROS）產(chǎn)生。此外，TPEN和PP2可明顯抑制SNAP在離體大鼠心臟中的抗梗死作用。
　　小結:
　　1.NO通過抑制復合體I阻止線粒體氧化應激，發(fā)揮再灌注心肌保護作用。