Notch1對(duì)PC12細(xì)胞自噬和生物學(xué)特性的影響.pdf

1、Notch基因在無脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物中都廣泛存在且高度表達(dá)，并且在不同物種間都具有高度的進(jìn)化保守性。Notch信號(hào)通路的功能復(fù)雜多樣，調(diào)控正常細(xì)胞的生長(zhǎng)分化，決定細(xì)胞的命運(yùn)，參與調(diào)控細(xì)胞生命活動(dòng)的方方面面，在哺乳類動(dòng)物中，Notch參與造血、T細(xì)胞發(fā)育、血管生成等重要生理過程，并與腫瘤形成和某些神經(jīng)系統(tǒng)疾病有密切關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)室采用Tet-on基因表達(dá)系統(tǒng)，建立了可動(dòng)態(tài)調(diào)控NICD基因表達(dá)的PC12-Notch1細(xì)胞系，克服了傳統(tǒng)研究方法

2、不能準(zhǔn)確調(diào)控細(xì)胞內(nèi)Notch1表達(dá)的缺點(diǎn)，有利于更好的研究Notch1對(duì)PC12細(xì)胞的作用以及其中的分子機(jī)制。自噬在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中有著重要作用，且已有研究表明Notch與自噬的信號(hào)調(diào)控有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)旨在PC12-Notch1細(xì)胞系的基礎(chǔ)上研究PC12細(xì)胞內(nèi)Notch1基因?qū)?xì)胞內(nèi)自噬和細(xì)胞生物學(xué)特性的影響及PI3K-AKT-MTOR通路mRNA的變化，探討可能的調(diào)控機(jī)制。
　　目的：
　　四環(huán)素衍生物強(qiáng)力霉素(DOX)動(dòng)態(tài)調(diào)

3、控Tet-on基因表達(dá)系統(tǒng)PC12-Notch1細(xì)胞中Notch1胞內(nèi)段(NICD)的表達(dá)，檢測(cè)在Notch1不同的表達(dá)水平上PC12細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞內(nèi)自噬水平的變化。研究Notch1基因?qū)?xì)胞內(nèi)自噬和細(xì)胞生物學(xué)特的影響及PI3K-AKT-MTOR通路mRNA的變化，探討其可能的調(diào)控機(jī)制。
　　方法：
　　1.檢測(cè)PC12-Notch1細(xì)胞內(nèi)NICD的表達(dá):復(fù)蘇PC12-Notch1細(xì)胞，取兩代之后的細(xì)胞接種六孔板，加入

4、四環(huán)素DOX(1ug/ml)誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)NICD的表達(dá)。根據(jù)DOX誘導(dǎo)時(shí)間分為六各不同時(shí)間組(分別是0h，12h，24h，36h，48h，60h)。熒光倒置顯微鏡下觀察不同誘導(dǎo)時(shí)間組內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)和細(xì)胞內(nèi)綠色熒光蛋白EGFP的表達(dá)，每孔計(jì)數(shù)三個(gè)視野內(nèi)的EGFP陽性表達(dá)率，最后計(jì)算平均值，得出各誘導(dǎo)時(shí)間組EGFP陽性細(xì)胞百分比。消化各組細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀測(cè)量各組細(xì)胞內(nèi)NICD的熒光表達(dá)強(qiáng)度，繪制DOX不同誘導(dǎo)時(shí)間點(diǎn)PC12-notch1細(xì)胞

5、內(nèi)NICD表達(dá)趨勢(shì)圖。
　　2.檢測(cè)高表達(dá)NICD的PC12-Notch1細(xì)胞周期和凋亡:將PC12-Notch1細(xì)胞接種六孔板，加入四環(huán)素DOX（1ug/ml）誘導(dǎo)NICD的表達(dá)，仍舊根據(jù)DOX誘導(dǎo)時(shí)間分為六各不同時(shí)間組（分別是0h，12h，24h，36h，48h，60h）。消化各時(shí)間組的細(xì)胞，上流式儀測(cè)量各時(shí)間組NICD不同的表達(dá)水平上細(xì)胞內(nèi)周期及凋亡率的變化。
　　3.PC12-Notch1細(xì)胞自噬的檢測(cè):消化各時(shí)間組

6、的細(xì)胞并提取蛋白質(zhì)，Westernblot檢測(cè)自噬標(biāo)志蛋白LC3B，Beclin1，ATG7，ATG5的表達(dá)。軟件分析曝光條帶灰度值并比較各時(shí)間組細(xì)胞內(nèi)自噬蛋白的表達(dá)差異。
　　4.熒光定量PCR檢測(cè)PC12-Notch1細(xì)胞內(nèi)自噬信號(hào)通路:提取各時(shí)間組細(xì)胞內(nèi)RNA，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，熒光定量PCR檢測(cè)PI3K、AKT、mTOR等基因的表達(dá)，比較在不同分組間mRNA表達(dá)差異。
　　結(jié)果：
　　1.熒光表達(dá)量:加

7、入DOX誘導(dǎo)后，在顯微鏡下觀察PC12-Notch1內(nèi)綠色熒光蛋白的表達(dá)量和流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度，發(fā)現(xiàn)0h組細(xì)胞未觀察到綠色熒光，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加，從12h組，24h組再到36h組細(xì)胞中綠色熒光蛋白表達(dá)量逐漸增加，細(xì)胞熒光表達(dá)率分別為20％，55％，71％。在誘導(dǎo)36h時(shí)熒光表達(dá)強(qiáng)度和熒光表達(dá)率達(dá)到最高，之后再持續(xù)給藥誘導(dǎo)48h，60h時(shí)發(fā)現(xiàn)NICD熒光表達(dá)率和表達(dá)強(qiáng)度有所下降，但都高于0h組，熒光表達(dá)率分別為63％，59％。各誘導(dǎo)

8、時(shí)間組細(xì)胞內(nèi)NICD的熒光強(qiáng)度都顯著高于非誘導(dǎo)組。
　　2.細(xì)胞周期和凋亡:在PC12-Notch1 DOX非誘導(dǎo)細(xì)胞組中，細(xì)胞的凋亡率維持較低水平。隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加直到最大誘導(dǎo)時(shí)間60h組，PC12-Notch1細(xì)胞凋亡率是逐漸升高的，60h時(shí)凋亡率達(dá)到最高，統(tǒng)計(jì)分析各誘導(dǎo)組與非誘導(dǎo)組相比都具有顯著向差異。在PC12-Notch1 DOX非誘導(dǎo)組細(xì)胞中，細(xì)胞的S期較高。從0h組開始隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加直到最大誘導(dǎo)時(shí)間60h組，P

9、C12-Notch1細(xì)胞周期中S期逐漸降低，60h組S期達(dá)到最低。
　　3.細(xì)胞自噬水平的變化:Westernblot檢測(cè)各時(shí)間組細(xì)胞內(nèi)自噬標(biāo)志蛋LC3B，Beclin1，ATG7，ATG5的表達(dá)。應(yīng)用軟件Image對(duì)曝光條帶灰度值分析得出這四種自噬蛋白的表達(dá)量先隨DOX誘導(dǎo)時(shí)間增加而升高到36h達(dá)到最高，說明此時(shí)細(xì)胞自噬水平達(dá)到高峰，之后再持續(xù)誘導(dǎo)48h，60h時(shí)發(fā)現(xiàn)灰度值呈現(xiàn)逐漸下降趨勢(shì)，但都高于0h組;方差分析得，各誘導(dǎo)時(shí)間

10、組細(xì)胞內(nèi)LC3B，Beclin1，ATG7，ATG5的表達(dá)量都顯著高于非誘導(dǎo)組。
　　4.熒光定量PCR檢測(cè)DOX不同誘導(dǎo)時(shí)間組PC12細(xì)胞內(nèi)基因PI3K、AKT、mTOR、GADPH的表達(dá)。分析結(jié)果可得:各個(gè)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)PI3K、AKT、mTOR的表達(dá)比非誘導(dǎo)組明顯降低，且具有顯著差異(P＜0.01)。
　　結(jié)論:
　　1.利用強(qiáng)力霉素(DOX)動(dòng)態(tài)調(diào)控Tet-on基因表達(dá)系統(tǒng)PC12-Notch1胞中Notch1胞