血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和端粒酶在翼狀胬肉中表達(dá)的研究.pdf

1、目的:翼狀胬肉是眼科較為常見的眼表疾病之一,現(xiàn)研究表明,翼狀胬肉是一種組織增生性結(jié)膜疾病,其發(fā)病機(jī)理仍不十分清楚,可能與細(xì)胞異常增殖和凋亡異常有關(guān)。由于翼狀胬肉術(shù)后的高復(fù)發(fā),有資料表明其與腫瘤有相關(guān)性,端粒酶在翼狀胬肉的高表達(dá)可能是一個(gè)重要因?yàn)?所以有必要將端粒酶進(jìn)行深入的研究。本實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展期翼狀胬肉組織端粒酶的活性和端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telemerase reverse transcriptase,hTERT)mRNA的表

2、達(dá)。增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)作為DNA聚合酶的輔助蛋白直接參與了細(xì)胞的增殖活性,在靜止期的細(xì)胞內(nèi)含量很少,從G1晚期開始增加,S期達(dá)高峰,G2期、M期明顯下降,故被認(rèn)為是一種準(zhǔn)確簡(jiǎn)便且可了解細(xì)胞增殖狀況的重要研究指標(biāo)。翼狀胬肉為增生性病變,本研究擬對(duì)病例組與正常組PCNA的免疫組化比較。VEGF是一種功能強(qiáng)大且能產(chǎn)生多種生物學(xué)效應(yīng)的細(xì)胞因子,它是1989年Ferra

3、rra在牛垂體濾泡星狀細(xì)胞培養(yǎng)液中分離純化出來(lái)的一類糖蛋白,是血小板衍生生長(zhǎng)因子(platelet derived growth factor PDGF)家族的一個(gè)成員,分子量為34—45 KD,序列高度保守,廣泛分布于人和動(dòng)物體內(nèi)的大腦、腎臟、肝臟、脾臟、胰腺和骨骼等組織中,它是最直接的血管內(nèi)皮細(xì)胞促分裂素,并且作為血管生成旁分泌刺激因子而被分泌。VEGF是目前研究發(fā)現(xiàn)的功能最強(qiáng)的血管形成促進(jìn)因子,它可以增強(qiáng)微血管的通透性,刺激內(nèi)皮細(xì)

4、胞分裂,增加組織因子和某些蛋白酶的產(chǎn)生。VEGF主要與VEGF受體相互作用,通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑引起血管通透性增加,促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移,從而誘導(dǎo)血管新生。有研究表明血管的生長(zhǎng)和成熟是高度復(fù)雜和協(xié)調(diào)的過(guò)程,需要用多種配體序貫活化一系列受體而完成。在正常生理性血管生長(zhǎng)過(guò)程中,如胚胎形成、骨骼生長(zhǎng)等,VEGF信號(hào)代表重要的限制酶,在病理情況下,可出現(xiàn)VEGF的異常表達(dá),在缺血性疾病中,缺氧可刺激VEGF表達(dá)上調(diào),通過(guò)對(duì)內(nèi)皮

5、細(xì)胞強(qiáng)烈的促有絲分裂作用,促進(jìn)新生血管形成；VEGF可以增加血管的通透性,尤其是微小血管的通透性,引起血漿蛋白滲漏到細(xì)胞外基質(zhì),在細(xì)胞外基質(zhì)中沉著,為成纖維細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷入提供條件基質(zhì),為腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和新生毛細(xì)血管網(wǎng)的建立提供營(yíng)養(yǎng)。以往翼狀胬肉被認(rèn)為是一種結(jié)膜組織的變性,近期的研究結(jié)果認(rèn)為,翼狀胬肉可能是一種生長(zhǎng)過(guò)程的紊亂。亦有研究表明,轉(zhuǎn)基因鼠在皮膚上過(guò)度表達(dá)’VEGF,明顯影響皮膚的血管新生,使皮膚出現(xiàn)類似牛皮癬樣的炎性反

6、應(yīng)。所以更有必要從以上的不同角度綜合進(jìn)行研究。本文從以下幾個(gè)方面進(jìn)行探討:
　　 1.通過(guò)對(duì)端粒酶的研究,深入了解翼狀胬肉的發(fā)病機(jī)制,為預(yù)防治療翼狀胬肉提供新思路。
　　 2.通過(guò)對(duì)VEGF表達(dá)的研究,了解翼狀胬肉的發(fā)生機(jī)制,提供降低其復(fù)發(fā)率的治療理論依據(jù)。
　　 3.探討端粒酶表達(dá)與VEGF表達(dá)的關(guān)系。
　　 方法:從本院2009.1-2009.9門診初發(fā)的進(jìn)行期翼狀胬肉手術(shù)患中選擇標(biāo)本二十二例,入選標(biāo)

7、準(zhǔn):男性11例,女性11例,年齡35.75歲,病程8月至20年,所有病例均無(wú)其他結(jié)膜、角膜疾病,排除鞏膜炎,色素膜炎等有關(guān)的疾病,排除腫瘤及免疫系統(tǒng)等引起眼部增生的全身疾病,術(shù)后經(jīng)病理檢查確診是翼狀胬肉的。另取年齡和條件相匹配的正常球結(jié)膜(,2mm×2mm)8例作為對(duì)照,其中男性5例,女性3例,年齡32-65歲。標(biāo)本經(jīng)10％甲醛固定,常規(guī)脫水、石蠟包埋,作3μm連續(xù)切片,分別進(jìn)行VEGF、PCNA、TERT免疫組織化學(xué)染色,并且對(duì)hTE

8、RT進(jìn)行原位雜交染色。
　　 結(jié)果判斷:胞漿內(nèi)有呈棕黃色顆粒反應(yīng)產(chǎn)物的為陽(yáng)性細(xì)胞。光鏡下每例標(biāo)本切片任取5個(gè)視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),至少計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞,以陽(yáng)性細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比表示陽(yáng)性表達(dá)率。A為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分級(jí):0～<1％=0,1～<10％=1,10～<50％=2,50～<80％=3,80～100％=4。B為陽(yáng)性細(xì)胞顯色強(qiáng)度分級(jí):0(陰性),1(弱陽(yáng)性),2(陽(yáng)性),3(強(qiáng)陽(yáng)性)。IHS=A×B
　　 統(tǒng)計(jì)方法:研究病例

9、組與正常組間均采用染色強(qiáng)度及染色陽(yáng)性率乘積的IHS評(píng)分,成組設(shè)計(jì)兩樣本比較的秩和檢驗(yàn),病例組hTERT和VEGF兩樣本比較的秩和檢驗(yàn)。所有分析采用spss16.0統(tǒng)計(jì)軟件包,取a=0.05做為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。
　　 結(jié)果:
　　 1病例組與正常組的VEGF:VEGF蛋白主要定位在血管內(nèi)皮和細(xì)胞漿表達(dá)細(xì)胞漿,胞核無(wú)著色,陽(yáng)性部位主要在上皮中的杯狀細(xì)胞(Fig.1)。兩組IHS數(shù)值比較Z值為-3.324,P值為0.001(<0.0

10、5)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Tablel)。
　　 2病例組與正常組的PCNA:PCNA抗體主要在細(xì)胞核表達(dá)(Fig.2)。兩組IHS數(shù)值比較Z值為-3.371,p值為0.001(<0.05)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Table2)。
　　 3病例組與正常組的hTERT:hTERT抗體主要在細(xì)胞漿表達(dá)(Fig.3)。兩組IHS數(shù)值比較Z值為-4.256,p值為0.000(<0.05)與對(duì)照組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Table3)。

11、　　 4病例組與正常組的hTERT mRNA:hTERT mRNA主要定位細(xì)胞漿,胞核無(wú)著色(Fig.4)。兩組IHS表比較Z值為-3.415,p值為0.001(<0.05)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Table4)。
　　 5病例組hTERT與VEGF的比較:兩組IHS數(shù)值比較Z值為-2.072,P值為0.038(<0.05)兩組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Table5)。
　　 結(jié)論:病例組VEGF,PCNA,hTERT,hTERT