Sonic hedgehog改善內(nèi)皮祖細(xì)胞功能促進(jìn)1型糖尿病傷口愈合的研究.pdf

1、本研究分為二部分：
　　第一部分、Sonic hedgehog改善1型糖尿病小鼠內(nèi)皮祖細(xì)胞功能
　　目的：探討Shh對(duì)1型糖尿病小鼠內(nèi)皮祖細(xì)胞遷移和血管生成功能的影響。
　　方法：
　　1.鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)C57BL／6雄鼠1型糖尿病模型后飼養(yǎng)10周，取骨髓培養(yǎng)內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs），于第7天給予Shh信號(hào)通路激動(dòng)劑（SAG）處理24h后用western blot法檢測(cè)下游因子GLI-1表達(dá)情況，觀察細(xì)胞

2、給于SAG后 Shh信號(hào)通路的變化，同時(shí)體外血管生成和細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)，觀察內(nèi)皮祖細(xì)胞shh通路激活后小管形成和遷移能力的變化。
　　2.鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)C57BL／6雄鼠1型糖尿病模型后飼養(yǎng)10周，取骨髓培養(yǎng)內(nèi)皮祖細(xì)胞，于第7天感染過表達(dá)Shh慢病毒24h后繼續(xù)培48h,用western blot法檢測(cè)下游因子GLI-1表達(dá)情況，觀察細(xì)胞感染過表達(dá)Shh慢病毒后Shh信號(hào)通路的變化，同時(shí)，用熒光顯微鏡直接觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況。體

3、外血管生成實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞遷移檢測(cè)，觀察內(nèi)皮祖細(xì)胞Shh通路激活后的小管形成和遷移能力的變化。
　　結(jié)果：
　　1.給于Shh信號(hào)通路激動(dòng)劑（SAG）處理的1型糖尿病內(nèi)皮祖細(xì)胞western blot法檢測(cè)中下游因子GLI-1蛋白表達(dá)增高（P<0.05），細(xì)胞小管形成能力（P<0.05）和遷移功能（P<0.05）得到改善。
　　2.過表達(dá)Shh慢病毒轉(zhuǎn)染處理的1型糖尿病內(nèi)皮祖細(xì)胞western blot法檢測(cè)中下游因子GLI

4、-1蛋白表達(dá)增加（P<0.05），細(xì)胞小管形成能力（P<0.05）和遷移功能（P<0.05）得到改善。
　　小結(jié)：
　　1. 1型糖尿病小鼠EPCs的Shh通路下調(diào)，給予激動(dòng)劑SAG可增加下游因子GLI-1蛋白的表達(dá)。
　　2．1型糖尿病小鼠EPCs功能下降，體外給予Shh受體激動(dòng)劑SAG，細(xì)胞小管形成能力（P<0.05）和遷移功能（P<0.05）得到改善。
　　3．糖尿病EPCs成功感染過表達(dá)Shh病毒，MOI

5、值為10.
　　4. Shh過表達(dá)糖尿病內(nèi)皮祖細(xì)胞western blot法檢測(cè)下游因子GLI-1蛋白表達(dá)增加（P<0.05）
　　5．Shh過表達(dá)糖尿病內(nèi)皮祖細(xì)胞，細(xì)胞小管形成能力（P<0.05）和遷移功能（P<0.05）得到改善。
　　第二部分、Sonic hedgehog過表達(dá)糖尿病內(nèi)皮祖細(xì)胞功能促進(jìn)1型糖尿病傷口愈合
　　目的：探討Shh過表達(dá)糖尿病內(nèi)皮祖細(xì)胞對(duì)1型糖尿病傷口愈合的影響。
　　方法：

6、
　　1. 1型糖尿病模型10周后建立皮膚全層缺損模型，隨機(jī)分為Control組， DM組，DM+EPCS組，在傷口周圍分別多點(diǎn)注射生理鹽水，內(nèi)皮祖細(xì)胞（來源于GFP小鼠）。定期觀察實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組傷口愈合情況，并于第18天取傷口周圍直徑1cm面積全層皮膚組織，冰凍切片后直接在熒光顯微鏡下觀察內(nèi)皮祖細(xì)胞參與傷口愈合的情況，用免疫組織化學(xué)法，HE染色法，觀察皮膚組織血管新生及肉芽組織修復(fù)情況。
　　2. 1型糖尿病模型10周后建

7、立皮膚全層缺損模型，隨機(jī)分為CONTROL組， DM組，DM+EPCS組，DM+EPCS(SHH)組，在傷口周圍分別多點(diǎn)注射生理鹽水，內(nèi)皮組細(xì)胞（來源于糖尿病小鼠），轉(zhuǎn)染過表達(dá)Shh慢病毒內(nèi)皮祖細(xì)胞。定期觀察實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組傷口愈合情況，并于第18天取傷口周圍直徑1cm面積全層皮膚組織，冰凍切片后用免疫組織化學(xué)法，HE染色法，Mason染色法觀察皮膚組織血管新生及膠原組織，肉芽組織修復(fù)情況。
　　結(jié)果：
　　1. 皮膚全層損傷

8、模型（1）顯示：與對(duì)照組相比，糖尿病傷口愈合緩慢（P<0.05）,內(nèi)皮祖細(xì)胞促進(jìn)糖尿病傷口愈合（P<0.05）。熒光顯微鏡下，內(nèi)皮祖細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組皮下組織可見位于散落點(diǎn)狀熒光。免疫組化顯示，內(nèi)皮祖細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組小血管數(shù)目多于糖尿病對(duì)照組。HE染色顯示，實(shí)驗(yàn)組與正常皮膚結(jié)構(gòu)形態(tài)相似，對(duì)照組可見上皮化，但上皮組織薄。
　　2. 皮膚全層損傷模型（2）顯示：糖尿病傷口愈合緩慢（P<0.05）,轉(zhuǎn)染過表達(dá)SHH慢病毒內(nèi)皮祖細(xì)胞促進(jìn)糖尿病傷口愈合（

9、P<0.05）。免疫組化顯示，實(shí)驗(yàn)組皮膚組織血管新生能力得到改善。HE染色和Mason染色顯示，實(shí)驗(yàn)組與正常皮膚結(jié)構(gòu)形態(tài)相似，對(duì)照組皮膚部分可見上皮化，但上皮細(xì)胞薄。
　　小結(jié)：
　　1. 正常內(nèi)皮祖細(xì)胞治療改善1型糖尿病傷口血管新生血管生成能力，促進(jìn)糖尿病傷口愈合。
　　2.與糖尿病內(nèi)皮祖細(xì)胞相比，過表達(dá)Shh糖尿病內(nèi)皮祖細(xì)胞能夠改善糖尿病傷口血管新生能力，促進(jìn)糖尿病傷口愈合。
　　全文結(jié)論：
　　糖尿病