水牛乳中β-乳球蛋白的IgG結(jié)合表位的定位研究.pdf

1、牛乳過敏是一種常見的食物過敏反應(yīng)，約1％～2％的成人和高達(dá)8％的三歲以下兒童會對牛乳產(chǎn)生食物過敏反應(yīng)。β-乳球蛋白是公認(rèn)的主要乳過敏原之一，大約82％的牛乳過敏患者對β-乳球蛋白過敏。由于牛乳β-乳球蛋白與水牛乳β-乳球蛋白的同源性很高，存在免疫交叉反應(yīng)。因此，探索水牛乳β-乳球蛋白的過敏問題具有重要的價值。 本論文開展的研究工作包括水牛乳β-乳球蛋白的分離純化、兔抗水牛乳β-乳球蛋白的抗原性評估、水牛乳β-乳球蛋白線性表位和構(gòu)

2、象型表位的定位，研究的主要方法、結(jié)果及結(jié)論如下： 1.水牛乳乳清經(jīng)過柱層析的分離后，采用SDS-PAGE、IEF-PAGE和ESI-Q-TOF-MS等方法對對分離組分進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，本研究建立的DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換結(jié)合Sephadex G-75凝膠層析方法可以分離純化水牛乳β-乳球蛋白，該方法分離得到的水牛乳β-乳球蛋白的抗原性完整，純度高達(dá)90％以上，并且適用于實(shí)驗(yàn)室小量和中量制備。

3、 2.以純化的水牛乳β-乳球蛋白為抗原，按常規(guī)的免疫程序?qū)θ毡敬蟀锥眠M(jìn)行免疫，間接非競爭ELISA檢測結(jié)果表明，日本大白耳兔對純化的水牛乳β-乳球蛋白具有很好的免疫應(yīng)答。通過間接ELISA、競爭抑制ELISA以及免疫印跡實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明本研究分離純化的水牛乳β-乳球蛋白的抗原性完好，并證明了水牛乳β-乳球蛋白與牛乳β-乳球蛋白存在較強(qiáng)的免疫交叉反應(yīng)，交叉率達(dá)到69.27％。 3.根據(jù)親和層析原理，將純化的水牛乳β-乳球蛋白耦

4、聯(lián)到溴化氰活化的Sepharose4B的免疫親合柱上，用3mol/L MgCl2將特異性兔血清IgG抗體洗脫，得到了SDS-PAGE純的IgG，其蛋白含量可達(dá)5.8mg/mL，經(jīng)ELISA檢測抗體效價滴度為1：109。因此，本研究建立的方法可用于純化兔血清中特異性的IgG抗體。 4.通過生物信息學(xué)分析，借助LasgrGene軟件和網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器，分別按Kyte-Doolittle方案預(yù)測水牛乳β-乳球蛋白的親水性區(qū)、Jameson-

5、Wolf方案評估蛋白質(zhì)的抗原性指數(shù)的高低、Emini方案尋找其表面可及性的位點(diǎn)，同時分別對其二級結(jié)構(gòu)的柔韌性區(qū)域、轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲的易形成區(qū)進(jìn)行預(yù)測，最后對以上多參數(shù)綜合分析，預(yù)測出了5個可能含有多個線性表位的區(qū)域：AA30-45，AA67-78，AA97-115，AA124-141，AA150-156。 5.通過采用特異性兔血清對噬菌體隨機(jī)七肽庫進(jìn)行親和淘選，在隨機(jī)挑選的300個克隆子中，篩選到了99個陽性克隆子，借助網(wǎng)絡(luò)工具

6、M1MOX分析，定位出了水牛乳β-乳球蛋白的6個模擬表位區(qū)：AA14-20,AA26-32,AA36-42，AA70-80，AA82-86以及AA149-156,其中AA70-80和AA149-156為主要表位區(qū)。 6.在表位預(yù)測和噬菌體肽庫篩選的基礎(chǔ)上，采用肽掃描定位的方法，尋找到了水牛乳β-乳球蛋白的兔血清IgG結(jié)合的7個線性表位，它們分別是AA2 1-30(SLAMAASDIS)AA25-34(AASDISLLDA)、AA

7、29-38(ISLLDAQSAP)、AA77-86(KIPAVFKIDA)、AA87-96(LNENKVLVLD)、AA134-143(EKFDKALKAL)和AA150-159(AFNPTQLEGQ)。 7.表位預(yù)測與表位篩選結(jié)果表明，30％的預(yù)測表位區(qū)出現(xiàn)在肽庫篩選的模擬表位中，而40％篩選的表位區(qū)未能通過生物信息學(xué)的方法預(yù)測到。與已報道的牛乳β-乳球蛋白的IgG結(jié)合表位相比，本研究發(fā)現(xiàn)了兩個兔血清IgG結(jié)合的新表位，它們分

8、別是AA134-143(EKFDKALKAL)和AA150-159(AFNPTQLEGQ)。 8.通過對噬菌體環(huán)七肽庫的淘選，篩選到了水牛乳β-乳球蛋白的兔血清IgG結(jié)合的構(gòu)象型模擬肽，以此為基礎(chǔ)，借助生物信息學(xué)的分析，定位出了水牛乳β-乳球蛋白的兔血清IgG結(jié)合的2個構(gòu)象型表位：Ser-Pro-Leu-Thr-Glu-Asn-Lys和Pro-Leu-Asn-Glu-Asn-Lys-Asn。 9.建立了噬菌體環(huán)七肽庫篩選