穩(wěn)定整合人乳鐵蛋白cDNA山羊胎兒成纖維細(xì)胞的制備.pdf

1、本研究從奶牛血液中提取基因組DNA，以其為模板，通過Long andAcute PCR擴(kuò)增β-酪蛋白5'端約長(zhǎng)6.5 kb和4.5 kb的兩段序列。凝膠回收純化后，分別將其連在pMD18-T載體上，組成質(zhì)粒pGBC6-5和pGBC4.5。經(jīng)測(cè)序分析，其與GenBank中登錄的山羊β-酪蛋白全基因序列基本相同。通過設(shè)計(jì)特異性引物在GBC6.5，GBC4.5的5、3'端分別加上BspE I和Sal I酶切位點(diǎn)。pGBC6.5和pGBC4.5

2、的PCR產(chǎn)物經(jīng)BspE I和Sal I雙酶切后，回收純化，分別克隆入pEGFP-C1載體，構(gòu)建出中間載體pEGFP-4.5和pEGFP-6.5。以pBL為模板，擴(kuò)增人乳鐵蛋白基因eDNA (hLF cDNA)，同時(shí)在其5'端加上Sal I酶切位點(diǎn)，在3'端加上Bam HI酶切位點(diǎn)。hLF cDNA的PCR產(chǎn)物經(jīng)Sal I、BamHI雙酶切后，回收純化，克隆至pEGFP-4.5和pEGFP-6.5。最終構(gòu)建p6.5hLF-EGFP和p4.

3、5hLF-EGFP乳腺特異性表達(dá)載體。 經(jīng)酶切，序列測(cè)定及PCR鑒定，表明載體成功構(gòu)建。載體的特點(diǎn)是：①調(diào)控序列GBC4.5為山羊β-酪蛋白啟動(dòng)子和增強(qiáng)子區(qū)域長(zhǎng)約4.5 kb的5'端側(cè)翼序列；GBC6.5為包括第一外顯子、第一內(nèi)含子和部分第二外顯子以及5'端側(cè)翼區(qū)共約6.5 kb的DNA序列。②設(shè)計(jì)引物時(shí)加終止密碼子TAA，防止β-酪蛋白與EGFP基因形成融合蛋白，以及保護(hù)堿基，保證較好的酶切效果。③載體含有EGFP基因和抗性基

4、因neo，用于對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的篩選。 通過脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染山羊胎兒成纖維細(xì)胞，經(jīng)G418抗性篩選3～4周后得到陽性細(xì)胞p6.5hLF-EGFP-FFC和p4.5hLF-EGFP-FFC;p6.5hLF-EGFP-FFC和p4.5hLF-EGFP-FFC經(jīng)多重PCR鑒定、EGFP表達(dá)檢測(cè)以及染色體核型分析后，得到穩(wěn)定整合有hLFcDNA且位于染色質(zhì)開放區(qū)的具有正常核型的山羊胎兒成纖維細(xì)胞系p6.5hLF-EGFP-FFC和p4.5hLF