褪黑素對大鼠腦出血后繼發(fā)性腦損傷的作用及機(jī)制研究.pdf

1、第一部分褪黑素對腦出血后小膠質(zhì)細(xì)胞活化和氧化應(yīng)激水平的影響
　　 目的：通過觀察大鼠腦出血后小膠質(zhì)細(xì)胞活化程度與SOD、MDA 動態(tài)變化以及褪黑素干預(yù)作用，探討褪黑素對腦出血后小膠質(zhì)細(xì)胞活化及氧化應(yīng)激水平的影響。
　　 方法：將Sprapue-Dawley 系雄性大鼠150只隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組、腦出血模型組（模型組）、褪黑素干預(yù)組（褪黑素組）；腦出血模型組、褪黑素組組內(nèi)隨機(jī)分為術(shù)后12h、1d、2d、4d、7d 共

2、5個(gè)時(shí)間點(diǎn)，按Rosenberg 法建立腦出血模型，褪黑素組每天腹腔注射1mg/ml 褪黑素10ml/kg；透射電鏡技術(shù)觀察腦出血出血側(cè)大腦皮層小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)變化；免疫組織化學(xué)方法觀察各組大鼠腦組織OX42 陽性細(xì)胞表達(dá)；黃嘌呤氧化法檢測血腫周圍腦組織超氧化物歧化酶（SOD）活性，硫代巴比妥酸比色法檢測腦組織丙二醛（MDA）含量。
　　 結(jié)果：透射電鏡結(jié)果顯示，腦出血后2d 時(shí)，模型組大腦皮層可見神經(jīng)元腫脹，小膠質(zhì)細(xì)胞活化、增殖

3、，褪黑素組同側(cè)皮層小膠質(zhì)細(xì)胞活化不明顯。免疫組化結(jié)果提示，假手術(shù)組、正常組大鼠僅見到少量OX42 陽性細(xì)胞表達(dá)，模型組腦出血后12h 時(shí)，血腫周圍可見大量OX42 陽性細(xì)胞表達(dá)，1d 時(shí)逐漸達(dá)到高峰，7d 時(shí)仍有表達(dá)，褪黑素組出血后各時(shí)間點(diǎn)，OX42 陽性細(xì)胞表達(dá)明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。模型組腦出血后血腫周圍腦組織MDA 含量顯著增高，1d 達(dá)到高峰，7d時(shí)仍高于正常水平，SOD 活性變化則與之相反；與模型組比較，褪黑素組MD

4、A 含量明顯降低，SOD 活性明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論：褪黑素通過抑制腦出血后小膠質(zhì)細(xì)胞活化、增殖，減輕神經(jīng)細(xì)胞損傷。其機(jī)制可能與褪黑素通過顯著減輕腦出血后腦組織氧化應(yīng)激水平，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞從靜息態(tài)向活化狀態(tài)轉(zhuǎn)變，從而減輕腦出血后繼發(fā)性腦組織損傷。
　　 第二部分褪黑素對腦出血后血腫周圍繼發(fā)性神經(jīng)細(xì)胞損傷的影響
　　 目的：通過觀察腦出血及褪黑素干預(yù)后神經(jīng)細(xì)胞凋亡和炎癥因子、凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，研

5、究炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡在腦出血后繼發(fā)性神經(jīng)細(xì)胞損傷機(jī)制中的作用，探討褪黑素對腦出血后遲發(fā)性神經(jīng)細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用及機(jī)制。
　　 方法：采用Rosenberg 法建立SD 大鼠腦出血模型，隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組、腦出血模型組、褪黑素干預(yù)組；采用TUNEL 原位細(xì)胞凋亡檢測評價(jià)腦出血后不同時(shí)間神經(jīng)元凋亡率；采用透射電鏡技術(shù)觀察出血側(cè)皮層神經(jīng)元形態(tài)及微血管結(jié)構(gòu)，免疫組織化學(xué)方法觀察各組大鼠腦組織NF-κB、Caspase-3 陽性細(xì)胞

6、表達(dá)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對各組大鼠腦組織Bax mRNA、Bcl-2 mRNA、MMP-2 mRNA、MMP-9 mRNA轉(zhuǎn)錄水平的動態(tài)變化進(jìn)行定量分析；Western blot 技術(shù)分析各組大鼠腦組織Caspase-3、TNF-α蛋白表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：正常組、假手術(shù)組大鼠未檢測到凋亡細(xì)胞，模型組出血后12h 時(shí)血腫周圍腦組織出現(xiàn)大量凋亡細(xì)胞，4d 時(shí)達(dá)到高峰，7d 時(shí)血腫周圍仍檢測到凋亡細(xì)胞，褪黑素組神經(jīng)細(xì)胞凋亡率明

7、顯下降，7d 時(shí)血腫周圍未檢測到凋亡細(xì)胞，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。透射電鏡結(jié)果示，模型組腦出血后2d 時(shí)出血側(cè)皮層神經(jīng)元胞漿腫脹明顯，微血管周圍明顯水腫，褪黑素組皮層神經(jīng)元形態(tài)基本正常。模型組及褪黑素組腦出血后12h 時(shí)NF-κB 陽性細(xì)胞表達(dá)明顯升高，4d 時(shí)達(dá)到高峰，褪黑素組腦出血后各時(shí)間點(diǎn)的NF-κB 陽性細(xì)胞表達(dá)率明顯低于模型組。腦出血后12h，模型組血腫周圍出現(xiàn)Caspase-3 陽性細(xì)胞表達(dá)，1d 時(shí)達(dá)到高峰，之后逐漸降低，7d

8、 時(shí)仍高于正常組，褪黑素組腦出血后各時(shí)間點(diǎn)Caspase-3 陽性細(xì)胞表達(dá)率低于模型組。熒光實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果示，腦出血后12h模型組Bax mRNA 轉(zhuǎn)錄水平升高，1d 時(shí)達(dá)到高峰，4d、7d 時(shí)仍明顯高于正常組水平，褪黑素組Bax mRNA 轉(zhuǎn)錄水平各時(shí)間點(diǎn)均低于模型組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；腦出血后12h 時(shí)褪黑素組Bcl-2 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平升高，1d 時(shí)達(dá)到高峰，4d、7d 時(shí)仍明顯高于模型組。腦出血后12h 至4d,褪黑素組與

9、模型組MMP-2 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平均逐漸升高，但兩組間無顯著差異，7d 時(shí)褪黑素組MMP-2mRNA 轉(zhuǎn)錄水平明顯低于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；模型組MMP-9 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平在腦出血后2d 時(shí)明顯升高并達(dá)到峰值，繼而下降，7d 時(shí)再次升高，褪黑素組MMP-9 mRNA表達(dá)峰值在出血后1d 時(shí)提前出現(xiàn)，之后下降至正常組水平，7d 時(shí)明顯高于模型組。腦出血后各時(shí)間點(diǎn)，褪黑素組Caspase-3、TNF-α蛋白表達(dá)均低于模型組。

10、r>　　 結(jié)論：腦出血后血腫周圍神經(jīng)細(xì)胞凋亡發(fā)生率與小膠質(zhì)細(xì)胞活化程度以及炎癥反應(yīng)程度存在相關(guān)性，褪黑素可抑制炎性因子的活化和釋放，減輕血管源性腦水腫，減少腦出血后遲發(fā)性神經(jīng)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與褪黑素抑制小膠質(zhì)細(xì)胞和NF-κB 活化，調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白酶轉(zhuǎn)錄，減輕炎癥反應(yīng)，同時(shí)上調(diào)Bcl-2基因表達(dá)，抑制Caspase-3表達(dá)有關(guān)。
　　 第三部分褪黑素對腦出血后神經(jīng)損傷修復(fù)的影響
　　 目的：通過觀察大鼠腦出血后膠質(zhì)

11、源性神經(jīng)生長因子、腦紅蛋白、線粒體轉(zhuǎn)錄因子A的動態(tài)表達(dá)及褪黑素干預(yù)作用，研究神經(jīng)細(xì)胞及線粒體自我修復(fù)功能在腦出血后繼發(fā)性腦損傷機(jī)制中的作用，探討褪黑素對腦出血后神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)修復(fù)功能的促進(jìn)作用及機(jī)制。
　　 方法：采用Rosenberg 法建立SD 大鼠腦出血模型、隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組、腦出血模型組、褪黑素組。分別于術(shù)后6h、1d、2d、4d、7d 時(shí)對大鼠進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評分，透射電鏡技術(shù)觀察腦出血后皮層神經(jīng)元

12、線粒體形態(tài)；免疫組織化學(xué)方法檢測各組大鼠腦組織膠質(zhì)源性神經(jīng)生長因子（GDNF）、腦紅蛋白(NGB)陽性細(xì)胞表達(dá)；熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)對各組大鼠腦組織GDNF、NGB、mtTFA mRNA 轉(zhuǎn)錄水平的動態(tài)變化進(jìn)行定量分析；Western blot 檢測各組大鼠腦組織GDNF 蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果：各組大鼠腦出血體積無明顯差異，褪黑素組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分低于模型組。免疫組化結(jié)果示，正常組、假手術(shù)組腦組織均可檢測到少量GDNF、

13、NGB 陽性細(xì)胞表達(dá)，腦出血后12h模型組GDNF 陽性細(xì)胞表達(dá)明顯升高，7d 時(shí)仍明顯高于正常組，褪黑素組GDNF 陽性細(xì)胞表達(dá)明顯高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。腦出血后12h模型組NGB 陽性細(xì)胞表達(dá)升高，1d 時(shí)NGB陽性細(xì)胞表達(dá)減少，2d-7d 時(shí)再次逐漸升高，褪黑素組NGB 陽性細(xì)胞表達(dá)率高于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。熒光實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果示，腦出血后12h 時(shí)褪黑素組GDNF mRNA 轉(zhuǎn)錄水平升高達(dá)到峰值，之后逐漸下降，

14、7d 時(shí)仍高于正常水平，模型組腦出血后1d 時(shí)GDNF mRNA 轉(zhuǎn)錄水平升高達(dá)到峰值，而后逐漸下降，7d 時(shí)仍高于正常水平；褪黑素組腦出血后12h 時(shí)NGB mRNA 轉(zhuǎn)錄水平升高到峰值，1d 至4d逐漸下降，仍高于正常組水平，7d 時(shí)NGB mRNA 轉(zhuǎn)錄水平明顯升高，模型組腦出血后1d 時(shí)NGB mRNA 轉(zhuǎn)錄水平顯著升高并達(dá)到峰值，2d 時(shí)迅速下降低于正常組水平，4d 至7d 時(shí)NGB mRNA轉(zhuǎn)錄水平再次明顯升高。褪黑素組腦出

15、血后12h 至1d 時(shí)mtTFAmRNA 轉(zhuǎn)錄水平明顯上調(diào)，模型組mtTFA mRNA 轉(zhuǎn)錄水平在1d 時(shí)升高至峰值，2d至7d 時(shí)褪黑素組mtTFA mRNA 轉(zhuǎn)錄上調(diào)水平高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。電鏡結(jié)果示腦出血后2d 時(shí)，模型組皮層神經(jīng)元線粒體腫脹，線粒體數(shù)量明顯減少、殘存線粒體向細(xì)胞壁移位，褪黑素組神經(jīng)元結(jié)構(gòu)及線粒體形態(tài)基本正常。腦出血后12h、4d、7d 時(shí)，褪黑素組GDNF 蛋白的表達(dá)高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。