結(jié)核分枝桿菌RmlA的表達(dá)、純化以及酶促反應(yīng)動力學(xué)研究.pdf

1、本研究的目的：(1)用pET29b表達(dá)載體在大腸桿菌中高表達(dá)結(jié)核分枝桿菌的RmlA蛋白質(zhì)；(2)采用親和層析技術(shù)純化RmlA蛋白質(zhì)；(3)用SDS-PAGE和Westernblot鑒定所純化的RmlA蛋白質(zhì)；(4)建立測定RmlA酶活性的方法；(5)確定RmlA酶的最佳反應(yīng)條件并測定RmlA酶的反應(yīng)動力學(xué)常數(shù)。 本研究所獲得的結(jié)果：1.誘導(dǎo)RmlA蛋白質(zhì)在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)用不同條件(IPTG濃度、誘導(dǎo)溫度及誘導(dǎo)時(shí)

2、間等)誘導(dǎo)rmlA基因的表達(dá)。用超聲方法破碎誘導(dǎo)的BL21(DE3)，對上清和沉淀組分進(jìn)行SDS-PAGE分析。結(jié)果表明RmlA酶蛋白在BL21(DE3)中得以表達(dá)，并且可以以可溶形式存在于上清中。 2.用Westernblot方法鑒定RmlA蛋白質(zhì)將SDS-PAGE凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用抗多聚組氨酸的單克隆抗體及偶聯(lián)堿性磷酸酶的馬抗小鼠IgG二抗進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，所表達(dá)的RmlA蛋白質(zhì)為rmlA基因產(chǎn)物。

3、 3.采用親和層析技術(shù)純化RmlA蛋白質(zhì)利用pET表達(dá)載體上的組氨酸標(biāo)記，采用組氨酸-Ni2+親和層析技術(shù)，純化RmlA蛋白質(zhì)。并且用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行蛋白定量，結(jié)果表明純化的第1mlRmlA蛋白質(zhì)的濃度為635.71μg/ml。 4.用SDS-PAGE和Westernblot鑒定所純化蛋白的純度將純化后收集的前3ml樣品進(jìn)行SDS-PAGE和Westernblot分析，結(jié)果表明純化的蛋白質(zhì)為RmlA蛋白質(zhì)，而且不存在其它雜蛋

4、白。 5.建立測定RmlA酶活性的方法(1)將反應(yīng)底物D-Glc-1-P和dTTP與純化的RmlA酶蛋白在37℃反應(yīng)30分鐘，用500mMKH2PO4終止反應(yīng)，然后采用高效液相色譜法(highperformanceliquidchromatography,HPLC)，應(yīng)用C18層析柱，在254nm處檢測到dTTP的減少和dTDP-D-Glc的生成，表明純化的RmlA蛋白質(zhì)具有酶活性。 (2)將反應(yīng)底物D-Glc-1-P和

5、dTTP與不同濃度的RmlA酶蛋白在37℃反應(yīng)不同的時(shí)間，用500mMKH2PO4終止反應(yīng)，然后用HPLC和C18層析柱在254nm處檢測產(chǎn)物dTDP-D-Glc的生成。繪制酶濃度曲線和反應(yīng)時(shí)間進(jìn)程曲線，結(jié)果表明RmlA酶蛋白反應(yīng)初速度的酶濃度范圍是1.27μg/ml，時(shí)間范圍是5min。 (3)在酶反應(yīng)初速度范圍，即酶濃度為1.27μg/ml，反應(yīng)時(shí)間為5min，分別改變反應(yīng)溫度(從20℃到90℃)和反應(yīng)的pH值，用HPLC和

6、C18層析柱檢測產(chǎn)物dTDP-D-Glc的生成量。結(jié)果表明RmlA酶蛋白的最適反應(yīng)溫度是40℃，最適pH值為8.0。 6.測定RmlA酶蛋白的反應(yīng)動力學(xué)常數(shù)采用最佳的酶反應(yīng)條件，即在40℃，pH值為8.0，酶濃度為1.27μg/ml，反應(yīng)時(shí)間為5min，分別用不同的底物濃度，進(jìn)行酶促反應(yīng)，然后用500mMKH2PO4終止反應(yīng)并用HPLC和C18層析柱在254nm處檢測產(chǎn)物dTDP-D-Glc的生成量。用雙倒數(shù)作圖法得出RmlA的

7、Km值和Vmax。對于底物dTTP，Km=0.019mmol/L，對于底物D-Glc-1-P，Km=0.870mmol/L。Vmax為160.56mmol/(L·min)。 結(jié)論：(1)用大腸桿菌BL21(DE3)所表達(dá)的可溶性結(jié)核分枝桿菌RmlA蛋白質(zhì)為純化RmlA蛋白質(zhì)并研究其酶促反應(yīng)動力學(xué)特性提供了保障。(2)建立了精確的RmlA酶活性測定方法，確定了RmlA的最佳反應(yīng)條件并測定了RmlA酶蛋白的反應(yīng)動力學(xué)常數(shù)Km和Vma