副溶血弧菌噬菌體固定化制劑的制備及其應(yīng)用.pdf

1、本文對(duì)副溶血弧菌噬菌體(Vibrio parahaemolyticus phage)進(jìn)行了固定化，制備出用于改善水體環(huán)境的噬菌體小球以及用于養(yǎng)殖動(dòng)物口服的噬菌體微膠囊，為噬菌體固定化制劑的研制及應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。具體研究結(jié)果如下：1.采用復(fù)相乳液法，以乙基纖維素為包囊材料，明膠溶液為保護(hù)液制取微膠囊。檢驗(yàn)了乙基纖維素溶液的濃度、攪拌速度、芯材：壁材的體積比以及保護(hù)液濃度對(duì)微膠囊制備的影響。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)，可以得到在實(shí)驗(yàn)條件下：攪

2、拌速度均為600r/min，時(shí)間30min，芯材：壁材為1:3，壁材濃度為3％，明膠濃度為2％時(shí)得到的微膠囊綜合評(píng)價(jià)最好。2.對(duì)噬菌體的吸附固定化實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：比較了4種吸附劑：滑石粉+硅藻土(3:1)，活性炭，蒙脫石，玻璃纖維對(duì)副溶血弧菌噬菌體的吸附效果。其中，蒙脫石和玻璃纖維對(duì)噬菌體的吸附效果稍好，但由于吸附同樣多的噬菌體，需要玻璃纖維的量(3g)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于蒙脫石(0.5g)的量，因而選擇蒙脫石作為噬菌體的吸附劑?？紤]了吸附劑的量、吸

3、附時(shí)間及吸附液的PH對(duì)噬菌體固定化的影響。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)，可以得到在實(shí)驗(yàn)條件下：蒙脫石的量為0.5g，吸附時(shí)間為1h，吸附液的PH為6時(shí)，吸附效果最佳。3.保護(hù)劑海藻糖的制取及對(duì)噬菌體的保護(hù)作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：采用黑曲霉和酵母兩步發(fā)酵木薯。測(cè)得黑曲霉在木薯培養(yǎng)液中在77—84h這段時(shí)間，發(fā)酵液中的還原糖的量達(dá)到最大，而在84h之前發(fā)酵液中總糖的量變化不大，之后隨著進(jìn)一步發(fā)酵，總糖的量逐漸減小。因而選在黑曲霉發(fā)酵木薯培養(yǎng)液80h左

4、右時(shí)加入酵母。在相同條件的情況下，經(jīng)黑曲霉發(fā)酵后的木薯培養(yǎng)液中所培養(yǎng)酵母菌數(shù)明顯多于未發(fā)酵的木薯培養(yǎng)液，且不將黑曲霉離心直接加入酵母發(fā)酵的效果好于離心后再加入酵母發(fā)酵的效果。另外，隨著發(fā)酵的進(jìn)行氨基酸的量都有了顯著的增加。800mL的酵母培養(yǎng)液經(jīng)離心后得到39.013g的酵母，煮沸提取后，經(jīng)過(guò)堿金屬(重金屬)除蛋白、活性炭脫色、陰陽(yáng)離子交換、膜過(guò)濾、濃縮、結(jié)晶、過(guò)濾及干燥即得到成品，采用紙層析初步鑒定為海藻糖，經(jīng)葸酮-硫酸法測(cè)得海藻糖的

5、量為705.09mg，可知，從酵母中提取海藻糖的得率為1.807mg/g(濕重)。由海藻糖對(duì)副溶血弧菌噬菌體的保護(hù)作用實(shí)驗(yàn)可知，在常溫條件下，海藻糖對(duì)副溶血弧菌噬菌體的保護(hù)作用不明顯，有、無(wú)海藻糖保護(hù)的噬菌體的效價(jià)相差不大，都在106pfu/mL，當(dāng)溫度超過(guò)60℃時(shí)，對(duì)噬菌體的保護(hù)作用較為明顯，有海藻糖保護(hù)的噬菌體的效價(jià)(1.6×106pfu/mL)比無(wú)海藻糖保護(hù)的噬菌體的效價(jià)(2.4×105pfu/mL)高了一個(gè)數(shù)量級(jí)。 由5

6、0℃水浴中作用不同時(shí)間的實(shí)驗(yàn)可知，作用10h以后，無(wú)海藻糖保護(hù)的噬菌體的效價(jià)(108)小于有海藻糖保護(hù)的噬菌體效價(jià)(109)一個(gè)數(shù)量級(jí)，說(shuō)明海藻糖對(duì)副溶血弧菌噬菌體有較有效的保護(hù)作用。而在4℃時(shí)，無(wú)海藻糖保護(hù)的噬菌體效價(jià)從1.2×108pfu/mL降為2.5×107pfu/mL，下降了一個(gè)數(shù)量級(jí)，而有海藻糖保護(hù)的噬菌體的效價(jià)從2.6×109pfu/mL降為5.8×108pfu/mL，也下降了一個(gè)數(shù)量級(jí)，但較無(wú)海藻糖保護(hù)的噬菌體下降的幅度

7、要小，酵母水提液中的噬菌體效價(jià)從7.3×108pfu/mL降為1.6×108pfu/mL，在同一數(shù)量級(jí)上，說(shuō)明在4℃時(shí)海藻糖對(duì)副溶血弧菌噬菌體略有保護(hù)作用，其低溫保護(hù)作用不如高溫保護(hù)作用明顯。4.以聚乙烯醇和海藻酸鈉為載體材料對(duì)噬菌體進(jìn)行包埋固定化得到大小為2—3mm左右的固定化小球。以此方法制得了三種小球：只加噬菌體的固定化小球I、蒙脫石先對(duì)噬菌體進(jìn)行吸附固定再進(jìn)行包埋固定的噬菌體小球II以及先在噬菌體中添加保護(hù)劑海藻糖，再蒙脫石吸附

8、固定，然后包埋固定的噬菌體小球III。將這三種小球分別投入200mL滅菌的海水中作用15d后，比較三種固定化小球在水體中的作用情況可知，噬菌體小球I和II在水體中的噬菌體的量開(kāi)始時(shí)是隨著小球中噬菌體的不斷釋放而增大，但增大到7d后，其量開(kāi)始減小，(噬菌體小球I從開(kāi)始的3.5×105pfu/mL增大到4.2×106pfu/mL，7d后開(kāi)始下降，15d時(shí)降到2.6×106pfu/mL，噬菌體小球II從開(kāi)始的6.2×104pfu/mL增大到2

9、.9×106pfu/mL，7d后開(kāi)始下降，15d時(shí)降到2.3×106pfu/mL)，而有海藻糖保護(hù)的噬菌體小球的水體中噬菌體的量仍然是不斷增大(從1.7×106pfu/mL增大到2.5×106pfu/mL)，說(shuō)明噬菌體小球III中噬菌體的活性好于小球I和II。15d后，噬菌體小球II和III中噬菌體的量(分別為0.4×108pfu/mL和0.8×108pfu/mL)多于噬菌體小球I中的量(9.0×106pfu/mL)，說(shuō)明噬菌體小球II