高脂飼養(yǎng)大鼠甘油三酯異位沉積與胰島素抵抗的關(guān)系.pdf

1、研究背景: 　近年來由于人們生活水平的提高、生活方式的改變、人口老齡化及肥胖等因素，T2DM的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈逐年增加的趨勢。大量流行病學資料顯示肥胖與T2DM發(fā)病有密切的關(guān)系。2001年，班廷獎得主McGarry教授在美國糖尿病協(xié)會年（ADA）上提出脂代謝障礙為T2DM及其并發(fā)癥的原發(fā)病理生理改變，2型糖尿?。═ype 2 diabetes mellitus，T2DM）中糖代謝紊亂的根源為脂代謝異常，并提出“糖尿病是糖脂?。╠

2、iabetes mellipitus）”的新概念。早在六十年代，研究人員就注意到游離脂肪酸(Free fatty acid,FFA)對葡萄糖代謝的影響，Randle等人在大量實驗的基礎(chǔ)上提出葡萄糖－脂肪酸循環(huán)（glucose-fatty acid cycle，Randle循環(huán)）的假說。九十年代，Grill等學者發(fā)現(xiàn)慢性FFA水平升高及胰島β細胞內(nèi)脂質(zhì)沉積可導致葡萄糖刺激的胰島素分泌(glucose-stimulated insulin

3、secretion，GSIS ) 障礙，胰島細胞出現(xiàn)脂性凋亡，再生能力減弱，從而提出“脂毒性”的概念。隨著研究的深入，研究人員發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)在骨骼肌、肝臟等非脂肪組織內(nèi)的沉積以及肥大的脂肪細胞產(chǎn)生的大量脂肪細胞因子與IR的發(fā)生密切相關(guān)。 “脂毒性”指FFA產(chǎn)生過多，超過組織氧化能力，F(xiàn)FA在非脂肪組織再酯化為TG，過多的TG沉積可以導致和加劇IR和β功能障礙。肝細胞內(nèi)TG增多導致肝胰島素與胰島素受體結(jié)合減少、高胰島素血癥、糖耐量減低，

4、引起肝臟IR；而骨骼肌細胞內(nèi)TG增高導致葡萄糖的攝取和利用降低，引起骨骼肌IR。研究發(fā)現(xiàn)：一方面，人類骨骼肌IR與二?；视?DAG)含量增加、蛋白激酶C(PKC)活性增高有關(guān)，并且與胰島素受體、IRS－1磷酸化增加導致的細胞內(nèi)信號傳導減弱有關(guān)。另一方面，血漿FFA長期持續(xù)升高使組織脂酰CoA 酯化為TG增多，導致細胞內(nèi)TG沉積，β細胞內(nèi)TG過度沉積引起β細胞GSIS障礙，β細胞凋亡增加，細胞數(shù)量減少[7]。其機制可能是血漿FFA升高導

5、致細胞內(nèi)脂酰CoA 升高,進而促進軟脂酰CoA及神經(jīng)酰胺生成增多，神經(jīng)酰胺可通過活化核因子κB(NF-κB) 上調(diào)iNOS ,使NO合成增加,NO源性的自由基生成增多,引起β細胞凋亡。但有研究認為, 胰島素抵抗可能通過減弱和/或損傷胰島素對脂肪代謝的調(diào)節(jié)作用，導致血漿游離脂肪酸增加，進而促進肝臟脂肪變性。有關(guān)FFA代謝障礙和TG異位沉積與IR之間的關(guān)系還不是十分清楚。故本研究擬利用高脂飼養(yǎng)SD大鼠，觀察大鼠胰島素抵抗發(fā)生早期階段，血漿F

6、FA，肝臟、骨骼肌和胰腺TG沉積變化特征，以期闡明血漿FFA、肝臟、骨骼肌和胰腺TG沉積與胰島素抵抗之間的關(guān)系。 目的: 以高脂飼料飼養(yǎng)SD大鼠，觀察大鼠空腹血漿胰島素和FFA水平，利用油紅O脂肪染色方法觀察大鼠肝臟、骨骼肌和胰腺組織甘油三酯沉積情況，探討高脂飼養(yǎng)大鼠血漿FFA水平和TG在肝臟、骨骼肌及胰腺沉積與IR發(fā)生的關(guān)系。 方法: 健康雄性9周齡SD大鼠60只，隨機分為高脂飼料飼養(yǎng)的實驗組和普通飼料

7、飼養(yǎng)的對照組，每組30只。再隨機將實驗組和對照組大鼠分為2周、4周和6周組，每組各10只。飼養(yǎng)過程中不限制大鼠飲食，兩組大鼠分別在實驗的第2周末、4周末和6周末處死。處死前12小時禁食，測量體重后采取尾部末梢血樣約1.0mL。采血后測定血糖，剩余血樣離心，上清液于－70℃冰箱保存，放射免疫法檢測血漿胰島素，銅顯色法檢測FFA。采血后處死動物，分別取實驗組和對照組動物肝臟、骨骼肌和胰腺，冰凍切片，進行油紅O染色標染脂肪。比較兩組大鼠血漿空

8、腹游離脂肪酸（FFA）、血漿胰島素（FINS）、空腹血糖（FBG）、肝臟、骨骼肌及胰腺TG 異位沉積的情況及胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR），探討血漿FFA、肝臟、骨骼肌和胰腺TG沉積與胰島素抵抗之間的關(guān)系。 主要實驗結(jié)果: 1．血糖、血漿胰島素、胰島素抵抗指數(shù)變化特點實驗2周組、4周組和6周組空腹血糖分別為5.14±0.41、5.20±0.47、5.32±0.54，與對照組（5.12±0.25、5.14±0.31、5.

9、12±0.46）比較無明顯差別（P >0.05）。實驗2周組FINS為13.60±2.07，與對照2周組比較無明顯差別（12.02±1.37,P >0.05）；實驗4周組FINS為25.05±2.95，與對照組比較明顯升高（12.57±1.20,P <0.01）;實驗6周組FINS為31.96±2.57，與對照組比較明顯升高（12.64±1.35, P <0.01）。實驗2周組胰島素抵抗指數(shù)為3.12±0.63，與對照2周組比較無明顯差

10、別（2.73±0.35,P >0.05）；實驗4周組為5.81±0.97，比對照組比較明顯升高（2.87±0.29,P <0.01）。實驗6周組胰島素抵抗指數(shù)為7.56±1.12，與對照組比較明顯升高（2.86±0.34, P <0.01）。 2．血漿FFA的濃度變化特點實驗2周組FFA為0.60±0.02，與對照2周組無明顯差別（0.57±0.03,P >0.05）；實驗4周組FFA為0.68±0.03，與對照4周組比較明顯升

11、高（0.60±0.04,P <0.01）;實驗6周組FFA為0.74±0.04，與對照組比較明顯升高（0.62±0.05, P <0.01）。以高脂2周組、4周組和6周組空腹血漿FFA和FINS進行線性相關(guān)分析顯示二者呈明顯的正相關(guān)關(guān)系（r＝0.617，P <0.01），以高脂2周組、4周組和6周組空腹血漿FFA和胰島素抵抗指數(shù)之間進行線性相關(guān)分析顯示二者呈明顯的正相關(guān)關(guān)系（r＝0.694，P <0.01），說明空腹血漿FFA與胰島素抵

12、抗密切相關(guān)。 3.肝臟、骨骼肌和胰腺油紅染色和灰度分析結(jié)果實驗2周組肝臟細胞未見脂滴形成，計算機半定量灰度分析值為151.0±5.20，與對照2周組比較無明顯差別（153.10±4.16，P >0.05）；實驗4周組肝臟細胞有大量脂滴分布，灰度分析值為113.75±6.52，與對照4周組比較差異顯著（140.65±5.12,P <0.01）；實驗6周組肝臟細胞脂滴非常明顯，灰度分值為99.50±4.67，與對照6周組比較差異顯著

13、（128.5±3.96,P <0.01）。實驗2周組肌細胞無明顯脂滴存在，灰度分析值為154.05±3.52，與對照2周組比較無明顯差別（155.00±5.6，P >0.05）；實驗4周組肌細胞脂滴明顯增加，灰度值為131.92±3.42，與對照4周組比較差異顯著（139.39±2.3，P <0.01）；實驗6周組肌細胞脂滴明顯增加，灰度分析結(jié)果為127.60±3.10，與對照6周組比較差異顯著（134.70±2.98，P <0.01）

14、。實驗2周組、4周組和6周組胰腺油紅O染色切片未見脂滴，灰度分析值分別為162.64±3.58、161.72±1.23、162.30±1.60，與對照各組（163.01±2.84、163.08±2.97、161.21±1.50）比較無明顯差別（P >0.05）。 4.油紅O染色切片灰度分析值與FINS相關(guān)性分析以高脂2周組、4周組和6周組肝臟染色灰度值和FINS之間進行線性相關(guān)分析呈明顯的負相關(guān)關(guān)系（r＝－0.882，P <0.

15、01），由于TG沉積量越多，灰度值越小，顯示肝臟TG含量與FINS呈正相關(guān)。以高脂2周組、4周組和6周組骨骼肌染色灰度值和FINS之間進行線性相關(guān)分析呈明顯的負相關(guān)關(guān)系（r＝－0.891，P <0.01），顯示肌細胞TG含量與FINS呈正相關(guān)，說明TG沉積與FINS水平升高密切相關(guān)。 5.油紅O染色切片灰度分析值與FFA相關(guān)性分析以高脂2周組、4周組和6周組肝臟染色灰度值和FFA之間進行線性相關(guān)分析呈明顯的負相關(guān)關(guān)系（r＝－0.

16、753，P <0.01），顯示肝臟TG含量與FFA呈正相關(guān)。以高脂2周組、4周組和6周組骨骼肌染色灰度值和FFA之間進行線性相關(guān)分析呈明顯的負相關(guān)關(guān)系（r＝－0.736，P <0.01），顯示肌細胞TG含量與FFA呈正相關(guān),說明TG沉積與空腹FFA水平升高密切相關(guān)。 結(jié)論: 1 高脂飼料飼養(yǎng)大鼠4周后可導致空腹血漿FFA和空腹血漿胰島素水平明顯升高，并且提示空腹血漿FFA水平升高與空腹血漿胰島素升高密切相關(guān)。 2