Rho激酶抑制劑Y-27632對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的研究.pdf

1、目的：1.研究Rho激酶抑制劑Y-27632對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone-marrbwmesenchymal stem cells，BMSCs)分裂增殖和細(xì)胞周期的影響。
　　2.研究Rho激酶抑制劑Y-27632聯(lián)合表皮刺激因子(EGF)和堿性成纖緇細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)，能否促進(jìn)大鼠BMSCs分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。
　　方法：1.采用改良的貼壁細(xì)胞培養(yǎng)法：體外分離培養(yǎng)SD大鼠BMSCs，96孔板中培養(yǎng)，取生長(zhǎng)

2、狀態(tài)良好的第二代BMSCs，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/孔，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組：實(shí)驗(yàn)組分別用2.5Bμmol/L、5.0μmmol/L、10.0μmmol/L、20.0μmmol/L濃度梯度的Y-27632與含10％FCS的DMEM/F12培養(yǎng)基共培養(yǎng)96h；對(duì)照組僅用含10％FCS的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)。四甲基偶氮唑藍(lán)[MTT]法檢測(cè)細(xì)胞的增殖，并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)，明確Y-27632促進(jìn)BMSCs增殖的最佳濃度；用流式細(xì)胞儀檢

3、測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)周期的變化。
　　2.取純化后的第三代大鼠BMSCs于6孔板中用含濃度為2％B27的Neurobasal無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)72h后，隨機(jī)分為：常規(guī)誘導(dǎo)組(EGF+bFGF)，Y-27632聯(lián)合常規(guī)誘導(dǎo)組(Y-27632+EGF+bFGF)，連續(xù)培養(yǎng)48h。顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，免疫熒光雙標(biāo)染色法分別檢測(cè)誘導(dǎo)分化的BMSCs中神經(jīng)元特異性稀醇化酶(NSE)和膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)的表達(dá)，并計(jì)算單位視野內(nèi)NSE、G

4、FAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目；Western-blot檢測(cè)NSE、GFAP表達(dá)水平。統(tǒng)計(jì)分析聯(lián)合應(yīng)用Y-27632對(duì)誘導(dǎo)大鼠BMSCs分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的影響。
　　結(jié)果：1.Y-27632對(duì)BMSCs細(xì)胞增殖與生長(zhǎng)的影響：
　　(1)對(duì)增殖的影響大鼠BMSCs培養(yǎng)24h，各組細(xì)胞吸光度(OD)值均維持在較低水平，各濃度組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；細(xì)胞培養(yǎng)48h，各組細(xì)胞OD值明顯上升，其中，10.0μmol/L組

5、細(xì)胞吸光度值升高明顯，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而其他實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；培養(yǎng)至96h，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且10.0μmol/L組與其他濃度組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說(shuō)明Y-27632可以促進(jìn)大鼠BMSCs的增殖，其促增殖效應(yīng)與作用濃度有關(guān)，其中10.0μmol/L促進(jìn)BMSCs增殖效應(yīng)優(yōu)于20.0μmol/L和5.0μmol/L。

6、r>　　(2)對(duì)細(xì)胞周期的影響流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)：對(duì)照組G0/G1期細(xì)胞比例為(80.640±5.516)％，S期細(xì)胞比例為(13.397±2.511)％；實(shí)驗(yàn)組G0/G1期細(xì)胞比例為(61.723±8.829)％，S期細(xì)胞比例為(29.380±7.630)％，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　2.聯(lián)合應(yīng)用Y-27632促進(jìn)大鼠BMSCs分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞兩組BMSCs細(xì)胞誘導(dǎo)12h，倒置顯微鏡可見(jiàn)培養(yǎng)細(xì)

7、胞胞體回縮，折光性增強(qiáng)，部分細(xì)胞出現(xiàn)神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞樣外觀；誘導(dǎo)24h，熒光顯微鏡可見(jiàn)同一細(xì)胞中NSE、GFAP兩種物質(zhì)共表達(dá)。誘導(dǎo)48h，BMSCs向神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系分化，其中常規(guī)誘導(dǎo)組，單位視野內(nèi)NSE陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量數(shù)為(83.200±8.677)個(gè)，GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量數(shù)為(96.30±8.486)個(gè)；Y-27632聯(lián)合誘導(dǎo)組，NSE陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量數(shù)為(109.20±8.430)個(gè)，GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量數(shù)為(107.50±8

8、.683)個(gè)；兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Western-blot檢測(cè)結(jié)果顯示；BMSCs誘導(dǎo)分化48h，誘導(dǎo)分化的細(xì)胞均表達(dá)NSE、GFAP兩種蛋白，而Y-27632聯(lián)合誘導(dǎo)組與常規(guī)誘導(dǎo)組相比，NSE、GFAP蛋白的表達(dá)均上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)條件下，
　　1.Y-27632可以促進(jìn)大鼠BMSCs的增殖，其最佳濃度為10.0μmol/L；
　　2.Y-27632可以促