補腎活血法對激素性股骨頭壞死家兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞增殖的影響.pdf

1、實驗?zāi)康模禾接懷a腎活血法對激素性股骨頭壞死的家兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（rBMSCs）的增殖水平及周期變化的影響，為臨床中藥治療股骨頭壞死，提供理論依據(jù)和合理的治療方法。
　　 實驗方法：1、首先進(jìn)行正常骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)。取4-8周齡日本大耳白兔一只，靜脈麻醉。無菌條件下，穿刺取骨髓液，注射器內(nèi)先抽吸含肝素的無菌PBS液，抽吸完畢迅速將注射器內(nèi)液體均勻混合。然后以等體積的PBS液稀釋，注入含有淋巴細(xì)胞分離液的離心管中,以200

2、0 r·min-1 離心收集有核細(xì)胞層,再用PBS洗滌，去除多余脂肪細(xì)胞及組織液后加入足量的胎牛血清，吹打、稀釋成細(xì)胞懸液，以一定密度接種于培養(yǎng)皿中。于適宜條件的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5d后換培養(yǎng)液棄去未貼壁細(xì)胞.繼續(xù)培養(yǎng)并且每周半量換液2次，待細(xì)胞生長接近匯合成單層時，用胰蛋白酶常規(guī)消化傳代。并逐日觀察其第1代、第2代、第3代細(xì)胞的生長增殖情況，繪制生長曲線圖。2、中藥含藥血清的制備。選取正常SPF級家兔，每日給予骨復(fù)生煎劑灌胃，另設(shè)5只對照

3、組以生理鹽水灌胃，連續(xù)7天，于最后一次灌藥后1小時(灌藥前禁食)，腹主動脈取血并分離血清，經(jīng)56℃，滅活，無菌過濾后，置冰箱保存?zhèn)溆谩?、含藥血清與骨髓基質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)方法根據(jù)實驗設(shè)計，當(dāng)?shù)?代的rBMSCs細(xì)胞貼壁生長達(dá)到70％-80％ 融合時，加入含藥血清終濃度分別為5％、10％及20％等3組及對照組,培養(yǎng)72小時。4、共培養(yǎng)后骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的增殖活性的變化共培養(yǎng)21小時，應(yīng)用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法測定細(xì)胞生長增殖水平及細(xì)胞周期