雷公藤紅素通過(guò)HIF-1α-Sema4D信號(hào)通路對(duì)乏氧誘導(dǎo)血管新生的抑制作用的研究.pdf

1、第一部分：
　　 目的：研究雷公藤紅素(Celastrol)對(duì)乏氧誘導(dǎo)的腫瘤血管新生的影響，并探討其可能機(jī)制。
　　 方法：不同濃度的Celastrol處理乏氧條件下的血管內(nèi)皮細(xì)胞株（EA.hy926)和腫瘤細(xì)胞株（HepG2和A549）6h或16h后，采用MTT法檢測(cè)Celastrol對(duì)乏氧條件下細(xì)胞增殖的影響；小管形成實(shí)驗(yàn)及遷徙實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Celastrol對(duì)乏氧誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞血管新生的影響；FITC-phalloidi

2、n及侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Celastrol對(duì)乏氧誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞侵襲能力的影響；Real-time PCR檢測(cè)Celastrol對(duì)乏氧條件下軸突導(dǎo)向因子4D（Semaphorin 4D，Sema4D）mRNA表達(dá)的影響；Western blot及ELISA檢測(cè)Celastrol對(duì)乏氧條件下Sema4D膜型及分泌型蛋白表達(dá)的影響。
　　 結(jié)果：Celastrol抑制乏氧條件下血管內(nèi)皮細(xì)胞(EA.hy926)及腫瘤細(xì)胞(A549和HepG2)

3、的增殖，干預(yù)6h后，IC50值分別為10.16±0.21，11.60±1.61，14.97±0.73μg/mL，作用時(shí)間延長(zhǎng)至16h時(shí)，IC50值分別為6.54±0.30，4.32±0.45，5.66±0.51μg/mL，其抑制作用呈劑量和時(shí)間依賴性；乏氧可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞遷徙，乏氧干預(yù)16h后，透膜細(xì)胞數(shù)量增加，給予0.25，0.75，2μg/mLCelastrol干預(yù)后，可劑量依賴性降低內(nèi)皮細(xì)胞遷徙；乏氧可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞小管形成，乏氧

4、干預(yù)16h后，細(xì)胞連接形成小管樣網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，給予0.25，0.75，2μg/mLCelastrol干預(yù)后，可劑量依賴性抑制內(nèi)皮細(xì)胞形成管腔的能力；乏氧可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞骨架重建，乏氧干預(yù)16h后，F(xiàn)-actin顯著增加，中間張力絲平行排列，細(xì)長(zhǎng)的絲狀偽足和片狀偽足明顯可見，給予2μg/mL Celastrol干預(yù)后，F(xiàn)-actin細(xì)胞形態(tài)明顯回復(fù)，僅見少量的絲狀和片層偽足；乏氧可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞侵襲，乏氧干預(yù)16h后，穿越Matrigel“屏

5、障”的細(xì)胞數(shù)量增加，給予0.25，0.75，2μg/mL Celastrol干預(yù)后，可劑量依賴性抑制腫瘤細(xì)胞侵襲；與單純乏氧組相比，Celastrol處理組明顯抑制A549細(xì)胞中Sema4D mRNA及膜型和分泌型蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)論：Celastrol能明顯抑制乏氧誘導(dǎo)的血管新生，下調(diào)Sema4D基因及蛋白的表達(dá)可能是Celastrol抗乏氧誘導(dǎo)的血管新生的重要機(jī)理之一。
　　 第二部分：
　　 目的：研究

6、雷公藤紅素(Celastrol)對(duì)乏氧誘導(dǎo)的HIF-1α信號(hào)通路及其上游信號(hào)通路PI3K/Akt的影響。
　　 方法：在乏氧條件下培養(yǎng)肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞16h，并以不同濃度Celastrol處理，采用免疫熒光及Western blot檢測(cè)Celastrol對(duì)乏氧誘導(dǎo)的細(xì)胞核內(nèi)HIF-1α表達(dá)的影響；Real-time PCR檢測(cè)Celastrol對(duì)常氧及乏氧條件下HIF-1αmRNA表達(dá)的影響；Real-time PCR檢

7、測(cè)Celastrol對(duì)HIF-1α靶基因VEGF及CA9 mRNA表達(dá)的影響；ELISA檢測(cè)Celastrol對(duì)VEGF蛋白表達(dá)的影響；Western blot檢測(cè)Celastrol對(duì)Akt及pAkt蛋白表達(dá)的影響。
　　 結(jié)果：常氧狀態(tài)下HepG2細(xì)胞中HIF-1α少量表達(dá)且主要表達(dá)于胞質(zhì)，單純乏氧組經(jīng)16h 乏氧干預(yù)后HIF-1α表達(dá)明顯上調(diào)且集中表達(dá)于胞核，給予2μg/mL Celastrol 干預(yù)后，HepG2細(xì)胞中HI

8、F-1α熒光染色強(qiáng)度明顯減弱且胞核中表達(dá)下降。Western blot 結(jié)果顯示，常氧下，HepG2細(xì)胞中僅有微量核蛋白表達(dá)。乏氧16 h，HepG2細(xì)胞中HIF-1α核蛋白表達(dá)顯著增加。給予2μg/mL或4μg/mLCelastrol 干預(yù)，HepG2細(xì)胞中HIF-1α核蛋白表達(dá)顯著降低。Real-time PCR結(jié)果顯示，常氧下，0.75-4μg/mL濃度范圍內(nèi)的Celastrol 對(duì)HIF-1αmRNA的表達(dá)有明顯的抑制作用。乏氧

9、下，0.25-4μg/mL 濃度范圍內(nèi)的Celastrol 對(duì)HIF-1αmRNA的表達(dá)有明顯的抑制作用，且呈劑量依賴性。單純乏氧組與常氧相比，VEGF和CA9mRNA表達(dá)量顯著增加，0.25-4μg/mL 濃度范圍內(nèi)的Celastrol 可明顯抑制乏氧誘導(dǎo)的VEGF和CA9 mRNA，且該作用呈劑量依賴性。ELISA 結(jié)果顯示，乏氧干預(yù)16 h后，VEGF的濃度顯著增加，給予濃度梯度為 0.25，0.75,2μg/mL Celastr

10、ol 處理后，VEGF 濃度明顯下降，且呈劑量依賴性。Western blot 結(jié)果顯示，乏氧下，HepG2細(xì)胞中Akt和pAkt 蛋白均有較強(qiáng)表達(dá)，給予0.25-4μg/mL Celastrol 干預(yù)，HepG2細(xì)胞中Akt和pAkt蛋白表達(dá)均顯著降低。
　　 結(jié)論：Celastrol能明顯抑制乏氧腫瘤細(xì)胞中HIF-1α信號(hào)通路，該作用部分是通過(guò)對(duì)PI3K/Akt通路的抑制實(shí)現(xiàn)的。下調(diào)HIF-1α基因及蛋白的表達(dá)可能是Cela