馬鹿(Cervus elaphus)鹿茸快速生長期生長點軟骨和茸皮組織microRNA表達譜研究.pdf

1、鹿茸是哺乳動物中唯一可以周期性表形態(tài)再生的哺乳動物器官，是研究再生醫(yī)學分子機制和調控模式的良好動物模型。鹿茸是公鹿額部生長的尚未骨化的嫩角，外面被有茸毛，內部是遍布神經和血管的結締組織和軟骨組織。鹿茸每年周期性地生長、脫落、完全再生，具有明顯的季節(jié)性。晚春和夏季是鹿茸的快速生長期，可達到2cm/d。鹿茸軟骨和茸皮組織相互促進共同完成鹿茸的再生，但是生長期鹿茸軟骨和茸皮相輔相成快速生長的分子機制尚不清楚。microRNAs(miRNAs)

2、是一類長約22nt、內源性的、轉錄后水平調控基因表達的非編碼的單鏈small RNA分子，主要在轉錄后負調控基因表達，通過與靶基因mRNAs3'非翻譯區(qū)(3'-UTR)的堿基互補配對來降解mRNAs或者抑制mRNAs翻譯，從而發(fā)揮沉默特定靶基因的作用。已證實miRNAs廣泛參與調節(jié)動物、植物和病毒生命過程，其功能幾乎涉及生命活動的各個方面。然而關于miRNAs調控鹿茸再生的研究報道極少。我們由此提出如下問題:鹿茸組織中是否有miRNAs

3、的表達？miRNAs在鹿茸不同組織中的表達量如何？研究這些問題可以進一步回答miRNAs與已知的鹿茸再生相關基因之間存在怎樣的相互作用關系？miRNAs是否在鹿茸再生過程中發(fā)揮重要作用？
　　本研究采集了東北馬鹿生長60天時的鹿茸，分離鹿茸軟骨和茸皮組織，進行鹿茸軟骨和茸皮small RNA文庫Solexa深度測序，然后用生物信息學方法對測序數據進行深入挖掘。本文主要研究包括:(1)進行鹿茸軟骨和茸皮small RNA高通量測序，

4、為miRNAs分析提供數據;(2)分析鹿茸軟骨和茸皮miRNAs，鑒定鹿茸保守和新型miRNAs;(3)分析鹿茸軟骨和茸皮miRNAs差異表達情況;(4)預測鹿茸miRNAs二級結構和靶基因，并進行靶基因功能注釋，探討miRNAs可能行使的生物學功能;(5) q-PCR驗證測序結果。
　　主要結果如下:
　　1、鹿茸軟骨和茸皮small RNA文庫進行miRNA Solexa測序后，分別獲得13，513，502和5，524，

5、073條原始序列讀數(raw reads)。經過各種質量控制程序處理后，得到9，520，645和3，621，894條高質量可比對序列讀數(mappable reads)，分別鑒定了389和295個miRNAs。
　　2、miRNAs的序列長度主要分布在18～25nt，其中鹿茸軟骨組織中序列讀數在18nt處達到峰值，茸皮組織中序列讀數在22nt處達到峰值，在鹿茸軟骨和茸皮文庫中分別占到31.5％、18.0％，說明測序結果富含潛在mi

6、RNAs。
　　3、篩選出7種類型的684個鹿茸miRNAs，其中611個為哺乳動物保守miRNAs，73個為鹿茸新的候選miRNAs。
　　4、結果顯示，所得單一miRNAs中有大量異構體isomiRNAs存在。其中293個保守miRNAs的末端堿基發(fā)生變化，堿基增加的數目大于減少的數目，且miRNAs3'端的堿基變化數目大于5'端;94個miRNAs發(fā)生堿基替換，包括62個轉換和32個顛換。
　　5、鹿茸軟骨和茸皮

7、文庫miRNAs的表達主要集中在表達量前20位的miRNAs上（均占所有miRNAs總拷貝數的80％以上），其中miR-21在鹿茸軟骨中拷貝數最高，miR-127在鹿茸茸皮中拷貝數最高。兩個組織間共有168個miRNAs表達存在差異，103個miRNAs表達差異顯著。
　　6、首次通過同源比對構建了馬鹿鹿茸的miRNAs表達譜。將鹿茸611個保守miRNAs與miRBase(v18.0)數據庫中已注釋的miRNAs序列進行比對，結

8、果顯示鹿茸和牛的保守miRNAs數目最多，達422個，其次為野豬(42)、小鼠(37)、綿羊(35)和人(27)。
　　7、用mfold軟件預測了鹿茸miRNAs前體二級結構，均可形成典型的發(fā)夾結構。此外，利用TargetScan軟件預測了鹿茸軟骨和茸皮文庫中保守和新發(fā)現的miRNAs（共39個）的靶基因，其功能有待進一步研究。
　　8、通過實時熒光定量PCR(RT-PCR)技術驗證了鹿茸軟骨和茸皮組織中拷貝數差異顯著或不顯

9、著的14條保守miRNAs在兩個文庫中的表達情況。結果表明，q-PCR的數據與測序數據基本一致。本次測序結果真實可靠，能夠反映鹿茸軟骨和茸皮miRNAs表達譜數據。
　　本研究從miRNA調控鹿茸生長發(fā)育的角度出發(fā)，通過高通量測序技術獲得快速生長期鹿茸軟骨和茸皮組織的miRNAs表達譜，分析其序列特征，檢測miRNAs在鹿茸快速生長期不同組織中的表達水平，篩選與鹿茸再生相關的miRNAs。馬鹿鹿茸軟骨和茸皮miRNAs的鑒定與功能