PPARgamma配體對糖尿病大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)、心房利鈉肽mRNA表達(dá)影響的研究.pdf

1、糖尿病患者正以驚人的速度增加。心血管病變是糖尿病的主要并發(fā)癥，與糖尿病死亡率直接相關(guān)。在排除缺血性心臟病、瓣膜性心臟病及高血壓性心臟病的糖尿病病人中，大量證據(jù)顯示糖尿病心肌病變的存在。糖尿病心肌病變的發(fā)生可能并非獨(dú)立，它可能是以心肌和冠脈系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能的改變?yōu)樘攸c(diǎn)的糖尿病并發(fā)癥。糖尿病心肌病變是否通過增加心肌缺血范圍或者改變心肌組織廣泛的代謝活動導(dǎo)致心功能下降仍是爭論不休的話題。屬于核受體超家族之一的過氧化物酶體增殖激活受體(Pero

2、xisomeproliferator-activatedreceptor，PPAR)gamma配體(代表物如羅格列酮)能改善胰島素敏感性降低血糖，同時具有抗增殖、抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用。臨床研究顯示PPARgamma配體能限制心肌梗塞范圍和改善心肌再灌注損傷，使合并糖尿病和心衰的患者獲益。心房利鈉肽是一種由心房和心室分泌的內(nèi)分泌激素，具有利鈉、利尿、擴(kuò)血管和拮抗腎素-血管緊張素系統(tǒng)的作用，目前發(fā)現(xiàn)很多病因?qū)е碌某溲孕牧λソ甙ㄐ募∪毖?、?/p>

3、血壓以及心臟特發(fā)性疾病血清中利鈉肽均升高。本實(shí)驗通過建立糖尿病大鼠模型，探討糖尿病大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)、心房利鈉肽表達(dá)的改變以及PPARgamma配體對其的作用。 材料與方法一.建立糖尿病動物模型1.購置50只10周齡Sprague-Dawley(SD)大鼠，其中雄性為25只，雌性為25只；平均體重315±30.06g，平均血糖96±4.86mg/L。 2.全部SD大鼠在浙江大學(xué)動物房清潔性(二級)條件下飼養(yǎng)，室內(nèi)溫度為20

4、～22℃，12小時光亮，12小時黑暗，食物與飲水能自由得到。 3.實(shí)驗組腹腔注射含STZ60mg/kg0.1MpH4.5枸櫞酸鈉液，對照組腹腔注射0.1MpH4.5枸櫞酸鈉緩沖液建立模型。50只大鼠分2大組：6周正常雌雄組、糖尿病雌雄組；10周正常雌雄組，糖尿病雌雄組和糖尿病羅格列酮雌雄組(羅格列酮1mg/kg/day以生理鹽水溶解后灌胃)。 4.糖尿病模型建立后，每天測尿糖。若尿糖+～+++，不予處理，尿糖≥++++，

5、則皮下注射精蛋白鋅胰島素1～3u。每周測血糖一次，以防止糖尿病大鼠出現(xiàn)高血糖性酮癥酸中毒，或高滲性昏迷導(dǎo)致死亡。 5.模型建立后6周和10周，大鼠以氯胺酮針35mg/kg和苯巴比妥針50mg/kg腹腔內(nèi)注射麻醉后，分別取左心室、左心房組織，大小5×5mm。心室用于電鏡觀察，左心房用于測定ANP基因表達(dá)。 二、透射電鏡標(biāo)本制作1.心室組織用0.2MPBS沖洗后入2.5％戊二醛固定。0.1MPBS沖洗，1％鋨酸固定1h，再用

6、0.1MPBS沖洗，2％醋酸鈾染色，30％，50％，70％，80％，90％，100％梯度酒精依次脫水，100％丙酮脫水，無水丙酮與包埋劑按1：1體積混合滲透組織，并振蕩2h。 2.純包埋劑滲透組織，并振蕩2h，隨后放入干燥箱內(nèi)，打開囊?guī)В屍溆啾獡]發(fā)，純包埋劑包埋。次日純包埋劑包埋組織置于聚合器中聚合37度，24h；45度，24h；60度，48h。 3.半薄切片和修塊：玻璃刀半薄切片，甲苯胺籃染色，光鏡下選取所要保留的

7、部位，用刀片將相應(yīng)包埋塊多余組織修去。 4.超薄切片、制刀：用LKB-7800型制刀機(jī)制玻璃刀，并做好水槽。 5.切片：調(diào)節(jié)樣本面與刀口，使二者平行，并在玻璃刀的水槽中注入雙蒸水，啟動自動切片開關(guān)，調(diào)節(jié)切片厚度，直至鏡下切出黃褐色的超薄切片(約120nm)。撈片：用200目銅網(wǎng)(銅網(wǎng)用丙酮經(jīng)超聲波清洗)撈片。 6.超薄切片染色：2％醋酸鈾染色；雙蒸水蘸洗；枸櫞酸鉛染色；氫氧化鈉液中蘸洗；再雙蒸水蘸水；最后將切片用

8、濾紙吸干。 7.荷蘭菲利浦TECNA10透射電鏡觀察。 三、Real-timePCR測定分析左心房ANPmRNA表達(dá)1.將保存在-80℃的所取心房組織研碎后，Trizol液抽提全部RNA，在260nm.進(jìn)行比色分析，測定總量RNA值。 2.普通RT-PCR確定該大鼠心房ANPmRNA存在表達(dá)的情況下，進(jìn)行熒光定量PCR檢測。 3.在Line-Gene熒光定量PCR檢測儀進(jìn)行Real-timePCR:引物和

9、探針序列(1)ANPmRNA引物：上游引物：5'GAGAGCGGACTAGGCTGCAA3’(456-555)下游引物：5'TCAGTGGCAATGCGACCAA3’(597-606)探針：5'CGGTACCGAAGATAACAGCCAAATCTGC3’(523-591) (2)看家基因β-actin引物：上游引物：5'-TCACCCACACTGTGCCCATCTATGA-3’下游引物：5'-CATCGGAACCGCTCATTG

10、CCGATAG-3’探針：5'-ACGCGCTCCCCCATGCCATCCTGCGT-3’CtANPmRNAANPmRNA=CtANPmRNA/Ctβ-actin 四、統(tǒng)計學(xué)處理：所有樣本數(shù)據(jù)均進(jìn)行均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差計算，SPSS10.0數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析(One-WayANOVA)。P＜0.05有顯著性差異，P＜0.01為有高度顯著性差異。 結(jié)果1.大鼠體重：STZ誘導(dǎo)建立的糖尿病大鼠體重顯著輕于正常對照組(P＜0.0

11、1)。羅格列酮治療組糖尿病大鼠血糖仍很高，體重反而增加，其中雌性糖尿病大鼠羅格列酮治療組與未用羅格列酮治療組相比，體重增加明顯，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。 2.大鼠血糖濃度：STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠的血糖顯著高于正常對照組(P＜.01)。糖尿病大鼠用羅格列酮治療組的血糖濃度有增高，但是與未用羅格列酮治療的糖尿病大鼠無顯著差異(P＞0.05)。 3.透射電子顯微鏡下觀察SD大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)。 (1).對照組大鼠心

12、肌結(jié)構(gòu)：心肌細(xì)胞胞漿含有豐富的肌原纖維束和線粒體，肌原纖維束與線粒體排列整齊緊致，Z線，A帶，M線，H帶，I帶清晰，很多的線粒體基膜完整，密布靠近肌原纖維，線粒體嵴整齊清晰，顯示細(xì)胞良好的氧化代謝功能，細(xì)胞核大而核仁色深。10周較6周大鼠相對稍差。 (2).糖尿病組大鼠心肌結(jié)構(gòu)：糖尿病組心肌細(xì)胞胞漿肌原纖維束減少、破裂、融合，肌原纖維束與線粒體排列大多紊亂，Z線，A帶，M線，H帶，I帶顯示不清，線粒體減少變小，非系統(tǒng)性地散在分布

13、，線粒體嵴排列混亂，細(xì)胞核固縮可見，核仁消失類似凋亡。10周更比6周糖尿病組大鼠差。 (3).羅格列酮治療糖尿病組大鼠心肌結(jié)構(gòu)：心肌結(jié)構(gòu)較糖尿病組完整清晰，Z線，A帶，M線排列清晰，心肌細(xì)胞胞漿肌原纖維束可見，基膜完整的線粒體分布于肌原纖維束間，線粒體嵴顯示細(xì)胞良好的氧化代謝功能，細(xì)胞核大而核仁存在。但較正常對照組，肌絲束線粒體變大變長。 4.左心房ANPmRNA表達(dá)因?qū)嶒炦^程中有2只大鼠(分別2C組和2D組)死亡，在剩

14、下的48個標(biāo)本中，在液氮冷凍時，由于液氮冷凍壓力過大沖破tuber蓋子使4個標(biāo)本丟失，最終44個標(biāo)本的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計，為了使組群間達(dá)到一定數(shù)量，把相同條件下的雌性和雄性并合成一大組。6周糖尿病大鼠心房組織ANPmRNA表達(dá)與對照組比較顯著增加(P＜0.05)，10周糖尿病大鼠心房組織ANPmRNA表達(dá)與對照組比較無顯著增加(P＞0.05)，10周用羅格列酮治療比沒有治療的糖尿病大鼠心房組織ANPmRNA表達(dá)顯著下降(P＜0.05)。