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文檔簡介
1、本實驗以白樺懸浮細(xì)胞為材料,將不同濃度硫化氫(H2S)供體硫氫化鈉(NaHS)添加到白樺懸浮培養(yǎng)體系中,篩選有利于白樺懸浮細(xì)胞生長、三萜、黃酮和多酚等次生代謝物積累的NaHS處理濃度和時間,并分析細(xì)胞內(nèi)吲哚乙酸(IAA)、脫落酸(ABA)、茉莉酸(JA)和多胺(PAs)的含量及其合成關(guān)鍵酶的活性或基因表達量。同時分析不同濃度IAA、ABA、PAs與NaHS共處理對白樺懸浮細(xì)胞生長和次生代謝物積累的影響。通過上述研究初步明確內(nèi)源性激素和次
2、生代謝物對H2S的響應(yīng),同時為明確白樺懸浮細(xì)胞中次生代謝積累的機制奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:
1.H2S對白樺懸浮細(xì)胞防御生理的影響
將0.1mmol/L、0.5mmol/L、1mmol/L和5mmol/L NaHS分別添加到培養(yǎng)8d的白樺懸浮培養(yǎng)體系中處理3~96h,研究發(fā)現(xiàn)0.1mmol/L NaHS處理提高了細(xì)胞活力同時促進了細(xì)胞生長,而高于1mmol/L NaHS處理則降低細(xì)胞活力和抑制細(xì)胞生長。其中,0.
3、1mmol/L NaHS處理96h時細(xì)胞活力最高,比對照組提高了37.66%。而5mmol/LNaHS處理96h時細(xì)胞活力最低,降低至對照組的24.09%。
不同濃度NaHS處理對pH、電導(dǎo)率和丙二醛含量的影響發(fā)現(xiàn),0.1mmol/LNaHS對pH、電導(dǎo)率和丙二醛含量的影響不顯著,與對照組相近。而高于1mmol/L NaHS處理則pH降低、電導(dǎo)率和丙二醛含量增加,其中5mmol/LNaHS處理96h時達到最大值,pH值下降0.
4、73,電導(dǎo)率提高了89.15%,丙二醛含量提高了44.62%。
不同濃度NaHS處理對超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)防御酶的影響發(fā)現(xiàn),除0.1mmol/L NaHS處理外,細(xì)胞內(nèi)防御酶活性均顯著提高。其中1mmol/L NaHS處理96h時SOD活性最高,比對照組提高了41.04%。1mmol/L NaHS處理24h時POD活性最高,比對照組提高了94.55%。1
5、mmol/L NaHS處理48h時CAT活性最高,比對照組提高了150%。0.5mmol/L NaHS處理24h時PAL活性最高,比對照組提高了71.43%。
2.H2S對白樺懸浮細(xì)胞中次生代謝物積累的影響
利用不同濃度NaHS處理白樺懸浮細(xì)胞。除5mmol/L NaHS外,NaHS處理提高了白樺懸浮細(xì)胞中次生代謝物含量。其中1mmol/L NaHS處理24h時次生代謝產(chǎn)物含量最高,三萜、黃酮、多酚含量分別比對照組提
6、高了36.67%、28.57%、36.89%。
低濃度NaHS處理有利于白樺懸浮細(xì)胞的生長,而較高濃度的NaHS處理有利于次生代謝物的累積,NaHS對次生代謝產(chǎn)產(chǎn)物促進作用多酚>三萜>黃銅。
3.H2S對白樺懸浮細(xì)胞中內(nèi)源性激素含量和合成關(guān)鍵酶基因表達的影響
利用不同濃度NaHS處理白樺懸浮細(xì)胞。NaHS處理降低了細(xì)胞內(nèi)IAA含量,而增加了ABA、JA和PAs含量。(1)0.5mmol/L以上NaHS處理組
7、IAA含量逐漸降低。其中在次生代謝產(chǎn)物積累最高的1mmol/L NaHS處理24h時IAA含量僅占對照組的46.78%,此時GH3.5A、GH3.5B、GH3.9A三個基因表達量分別比對照組提高158.12%、307.47%、509.73%倍(TU內(nèi)參);(2) NaHS處理后ABA含量呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢。其中1mmol/L NaHS處理12h時ABA含量最高,比對照組提高了196.46%。而NCED4基因在1mmol/L NaHS
8、處理6h時表達量最高,比對照組提高了431.85%。(3) NaHS處理后總PAs含量提高。其中,1mmol/L NaHS處理12h時精胺酸脫羧酶活性最高比對照提高了15.91%,96h時總腐胺含量最高比對照組提高了20.34%。0.5mmol/L NaHS處理48h時S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶活性最高比對照提高了74.15%,總亞精胺含量最高比對照組提高8.41%(4) NaHS處理后JA含量呈先提高后降低趨勢。其中1mmol/L NaH
9、S處理12h時脂氧合酶活性最高,比對照組提高了22.39%,24h時JA含量最高,比對照組提高了67.17%。
NaHS處理后激素調(diào)控相關(guān)基因與激素合成酶活性改變誘導(dǎo)了細(xì)胞內(nèi)源性激素含量的變化。下面繼續(xù)探究激素含量與次生代謝產(chǎn)物積累的關(guān)系。
4.H2S與激素共處理對白樺懸浮細(xì)胞次生代謝積累的影響
將不同濃度的IAA、ABA、Put、Spd、Spm分別添加到8天的白樺懸浮細(xì)胞中,使培養(yǎng)基中不同激素終濃度為0.
10、1mmol/L、0.5mmol/L、1mmol/L和5mmol/L。同時分別將上述不同激素的濃度處理與1mmol/L的硫氫化鈉共處理白樺懸浮細(xì)胞處理24h。研究發(fā)現(xiàn)IAA處理降低了次生代謝產(chǎn)物積累,而ABA和PAs處理促進了次生代謝產(chǎn)物的積累。(1)5mmol/L IAA處理次生代謝產(chǎn)物含量最低,多酚、黃酮和三萜含量分別為對照組的88.28%、86.44%和78.91%。5mmol/L IAA和1mmol/L硫氫化鈉共處理次生代謝產(chǎn)物含
11、量比IAA處理組提高,多酚、黃酮和三萜含量分別為對照組的111.16%、107.39%和93.82%。(2)1mmol/L ABA處理次生代謝產(chǎn)物含量最高,多酚、黃酮和三萜含量分別比對照組提高17.85%、23.48%和16.73%。1mmol/L ABA和1mmol/L硫氫化鈉共處理次生代謝產(chǎn)物含量提高,多酚、黃酮和三萜含量分別比對照組提高58.19%、46.02%和57.30%。(3)5mmol/L腐胺處理組中三萜含量最高比對照組提
12、高了22.91%,與硫氫化鈉共處理時三萜含量比對照提高了68.00%。1mmol/L精胺處理組中黃酮含量最高比對照提高了31.09%,與硫氫化鈉共處理時黃酮含量比對照組提高了48.62%。0.5mmol/L亞精胺處理組中多酚含量最高比對照組提高了37.17%,與硫氫化鈉共處理時多酚含量比對照提高了75.91%。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)IAA和Put與次生代謝產(chǎn)物積累顯著相關(guān),低于1mmol/L的ABA、Spd和SPM促進次生代謝產(chǎn)物積累。
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