主要果蔬作物灰霉病菌分子檢測及鑒定研究.pdf

1、灰霉病(gray mold)由葡萄孢屬真菌（Botrytis spp.）和類似葡萄孢屬真菌（Botrytis-like fungi）引起。利用分子檢測的方法預(yù)測果蔬灰霉病菌以及鑒定病原種類是一種快速便捷的手段。前期研究已經(jīng)明確大部分果蔬灰霉病病原種類，但大多數(shù)植物灰霉病菌都缺乏特異性分子檢測和鑒定體系。針對上述問題，本研究以蠶豆赤斑病病原，蔥屬作物灰霉病病原，葡萄灰霉病病原為材料，研究其分子檢測及鑒定方法。獲得了以下研究結(jié)果:
　

2、　1.建立了區(qū)分蠶豆上三種葡萄孢屬真菌（灰葡萄孢Botrytis cineea、蠶豆葡萄孢B.fabae和擬蠶豆葡萄孢B.fabiopsis）的分子標(biāo)記及檢測鑒定方法。采用RAPD和SCAR標(biāo)記技術(shù)分別獲得了檢測和鑒定B.cnema和B.fabiopsis的特異PCR引物Bc-f/Bc-r和Bfab-f/Bfab-r。利用NEP1基因序列（編碼壞死及乙烯誘導(dǎo)蛋白1）設(shè)計(jì)出檢測和鑒定B.fabae的特異PCR引物對Bfa-f/Bfa-r。

3、這三對引物能在單獨(dú)PCR擴(kuò)增及混合PCR擴(kuò)增的條件下擴(kuò)增出相應(yīng)種葡萄孢的基因組DNA，呈現(xiàn)出高度特異性。在25μL的PCR反應(yīng)體系中，三對引物的靈敏度分別為:B.fabae40 pg DNA、B.fabiopsis40pg DNA和B.cineea400 pg DNA。當(dāng)PCR反應(yīng)體系中蠶豆DNA和Botrytis DNA重量比達(dá)到1000∶1(w/w)時(shí)，不影響三對引物對目標(biāo)Botrytis的檢測。同時(shí)，多重PCR能檢測出人工接種葉片

4、和田間葉片中的3種葡萄孢。以上結(jié)果顯示，本研究開發(fā)的多重PCR方法能被用來檢測和鑒定蠶豆赤斑病菌。
　　2.建立了區(qū)分葡萄上四種葡萄孢屬真菌（灰葡萄孢Botrytis cineea、假灰葡萄孢B.pseudocinerea、中國葡萄生葡萄孢B.sinoviticola和未定名種Botrytis sp.2）的分子標(biāo)記及檢測鑒定方法。采用RAPD和SCAR標(biāo)記技術(shù)分別獲得了檢測和鑒定B.cineea、B.pseudocinerea、B

5、.sinoviticola和和Botrytis sp.2的特異PCR引物對Bc-f/Bc-r、Bps-f/Bps-r、Bsa-f/Bsa-r和Bsp2-f/Bsp2-r。這四對引物在單獨(dú)PCR擴(kuò)增的條件下能擴(kuò)增出相應(yīng)葡萄孢種的基因組DNA，呈現(xiàn)出高度特異性。在25μL的PCR反應(yīng)體系中，四對引物的靈敏度分別為0.7 ng B.pseudocinerea DNA、0.7 ng B.sinoviticola DNA、0.7 ng Botry

6、tis sp.2 DNA和400 pg B.cinema DNA。同時(shí)，單對引物PCR能檢測人工接種葉片中的4種葡萄孢。
　　3.建立了區(qū)分蔥屬植物上六種葡萄孢屬真菌（蔥腐葡萄孢B.aclada、蔥細(xì)絲葡萄孢B.byssoidea、灰葡萄孢B.cinerea大蒜盲種葡萄孢B.porri、蔥鱗葡萄孢B.squamosa和中國蔥葡萄孢B.sinoallii）的分子標(biāo)記及檢測鑒定方法。采用RAPD和SCAR標(biāo)記技術(shù)分別獲得了檢測和鑒定B

7、.cinerea、B.aclada、B.byssoidea、B.porri、B.squamosa和B.sinoallii的特異PCR引物對Bc-f/Bc-r、Bac-f/Bac-r、Bby-f/Bby-r、Bpo-f/Bpo-r、Bsq-f/Bsq-r和Bsi-f/Bsi-r。這六對引物在單獨(dú)PCR擴(kuò)增的條件下能擴(kuò)增出相應(yīng)葡萄孢種的基因組DNA，呈現(xiàn)出高度的特異性。在25μL的PCR反應(yīng)體系中，六對引物的靈敏度分別為0.07 ngB.a

8、clada DNA、0.07 ngB.byssoide DNA、7 pgB.porri DNA、7 pg B.sinoallii DNA、7 pgB.squamosa DNA和400 pg B.cinerea DNA。同時(shí)，單對引物PCR能檢測出人工接種葉片中的6種葡萄孢
　　4.以Botrytis屬及其近緣屬32個(gè)種共63個(gè)菌株為材料，探討了ITS及三個(gè)核基因（G3PDH、 HSP60和RPB2）作為Botrytis屬DNA條形

9、碼的可能性。通過分析Botrytis種間和種內(nèi)的差異以及系統(tǒng)發(fā)育樹聚類結(jié)果，選定G3PDH基因的部分序列作為Botrytis屬DNA條形碼，同時(shí)設(shè)計(jì)獲得DNA條形碼PCR引物G31-f/G31-r擴(kuò)增Botrytis屬及其近緣屬真菌，均能產(chǎn)生789 bp～798 bp大小的片段。測序結(jié)果顯示:擴(kuò)增得到的DNA片段可以區(qū)分不同種葡萄孢。由此證實(shí)G3PDH基因部分序列可以用于區(qū)分葡萄孢屬真菌的DNA條形碼。
　　本研究獲得的PCR引物