水葫蘆葉枯病診斷及其病原菌的生物學(xué)和病理學(xué)特性.pdf

1、水葫蘆[Eichhornia crassipes(Mart.)Solms]是一種原產(chǎn)于南美的雨久花科(Pontederiaceae Kunth)植物，是世界十大害草和我國(guó)重要的外來(lái)入侵植物之一。通過(guò)廣泛調(diào)查采樣和室內(nèi)分離純化，從水葫蘆植株上獲得3個(gè)病原真菌菌株，進(jìn)行了致病力測(cè)定和篩選，得到1個(gè)致病力較強(qiáng)的水葫蘆鏈格孢Alternaria sp.APT001菌株。本研究測(cè)定該菌株主要生物學(xué)特性及其對(duì)水葫蘆雜草的致病作用，用有機(jī)溶劑萃取獲得

2、了粗毒素，并測(cè)定了毒素對(duì)水葫蘆的致病活性。 1.從水葫蘆雜草上分離純化得到了APT001、FPT001和PPT001三種真菌菌株，經(jīng)過(guò)初步鑒定分別為鏈格孢Alternaria sp.，鐮刀菌Fusarium sp.和擬盤多毛孢Pestalotiopsis sp.。通過(guò)接種比較它們對(duì)水葫蘆的致病力發(fā)現(xiàn)，鏈格孢Alternaria sp.菌株(APT001)對(duì)雜草的毒性或致病力最強(qiáng)，在葉部形成褐色枯萎病斑，診斷為水葫蘆葉枯病。在溫室

3、條件下用該菌株菌絲片段懸浮液噴霧接種，雜草植株100％感病，4wk后，葉平均病害嚴(yán)重度達(dá)6.83，在5wk內(nèi)能夠殺死所有接種的葉片，造成總體的葉平均病害嚴(yán)重度達(dá)7.97。 2.該菌在PSA培養(yǎng)基上菌落生長(zhǎng)速度很快，菌落為黑綠色，覆蓋白色氣生菌絲，在25℃下培養(yǎng)5d后菌落直徑達(dá)到70.1mm；分生孢子鏈生(一般7.12個(gè)孢子)，孢身24.7(12.5-37.5)×10.1(7.5-12.5)μm，具短喙或無(wú)喙，8.96(5-16.

4、25)×5.42(3.75-5)μm，淡褐色至中度褐色，具1-3個(gè)橫隔，0-4個(gè)縱隔；分生孢子梗直或彎曲，分隔，不分枝或分枝，極淡的褐色至淡褐色；結(jié)合病菌的形態(tài)及菌落產(chǎn)生色素和毒素的特點(diǎn)，該菌應(yīng)為細(xì)極鏈格孢組(Alternaia tenuissimagroup),的一個(gè)成員(member)，但還需利用分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。 3.在初步驗(yàn)證光照、空氣和濕度列AFF001沒(méi)有明顯影響之后，本研究進(jìn)一步測(cè)定了培養(yǎng)基、溫度和酸堿

5、度對(duì)該菌生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響。真菌菌落生長(zhǎng)的溫度范圍為15-30℃，在25℃時(shí)生長(zhǎng)最快，菌落平均生長(zhǎng)直徑為70mm；不同的培養(yǎng)基對(duì)菌落的生長(zhǎng)有非常顯著的影響(P＜0.01)，對(duì)WA、CAA、PSA、PDA、OSA、WLA、WLA+PDA和WIA+PSA等8種培養(yǎng)基的測(cè)定結(jié)果顯示，真菌都能夠正常生長(zhǎng)，而在清水洋菜培養(yǎng)基(WA)上菌絲生長(zhǎng)較稀疏，馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基(PSA)是該真菌的最佳培養(yǎng)基，在pH4.0-12.0的范圍內(nèi)，菌落生長(zhǎng)的適宜酸堿度

6、范圍是pH6.5-10，最適約為pH9.0，培養(yǎng)6d后達(dá)到74.5mm，當(dāng)pH4.0和pH12.0時(shí)菌落生長(zhǎng)明顯較緩慢；在PSA培養(yǎng)基上，溫度和酸堿度對(duì)該菌的生長(zhǎng)具有極其顯著的影響(P＜0.01)，培養(yǎng)基、溫度和酸堿度是該菌三個(gè)主要影響因素，最佳培養(yǎng)基、溫度和酸堿度分別是PSA、25℃和pH9.0。所以是在目光燈(12L/12D)、近紫外光(12L/12D)和全黑暗條件下，最適合該菌產(chǎn)孢的光照條件是近紫外光(12L/12D)，培養(yǎng)20d

7、后產(chǎn)孢量達(dá)到3.44x105/平皿，是日光燈照射處理的2.53倍，全黑暗培養(yǎng)。 4.在室內(nèi)控制條件下測(cè)定，溫度對(duì)水葫蘆鏈格孢的致病力有顯著的影響，30℃處理的原生葉片的病害嚴(yán)重度明顯高于20℃和25℃兩個(gè)處理，達(dá)到7.77厘；保濕處理時(shí)間設(shè)定為0-48h,在24h以上，植株感病率均為100％，葉平均病害嚴(yán)重度進(jìn)一步提高，但增長(zhǎng)速度較緩慢，保濕48h葉平均病害嚴(yán)重度最高，達(dá)到6.54：光照強(qiáng)度對(duì)菌絲的侵染有一定的影響，其在一定程度

8、上強(qiáng)光照對(duì)菌絲的侵染有抑制作用。 5.病菌用馬鈴薯蔗糖(PS)液體培養(yǎng)基培養(yǎng)20d后，光培養(yǎng)與暗培養(yǎng)條件下的培養(yǎng)濾液對(duì)水葫蘆葉片和植株均表現(xiàn)出較強(qiáng)的致毒活性。用此濾液處理水葫蘆葉片，4d后葉片大面積黃化，并伴有黑色針狀小斑點(diǎn)。浸漬保濕處理與直接浸漬處理的效果相同，刺傷葉片和不刺傀葉片發(fā)病程度相同；噴霧保濕處理的效果不如上述兩種處理，雖然也會(huì)出現(xiàn)水漬狀黃色病斑，但面積較小。 6.使用常用三種有機(jī)溶劑對(duì)鏈格孢培養(yǎng)濾液進(jìn)行萃取

9、，乙酸乙脂和氯仿均可萃取得到棕紅色的粗毒素，但是乙酸乙酯的回收率最高，可達(dá)90％以上，石油醚萃取不能得到毒素；采用針刺法分別用兩種有機(jī)溶劑獲得的粗毒素處理水葫蘆葉片，3d后均產(chǎn)生致毒活性，出現(xiàn)棕色病斑，并伴有黃化；實(shí)驗(yàn)測(cè)定表明，在pH4.0-11.0的范圍內(nèi)和經(jīng)過(guò)120℃及以下的溫度處理1h后，鏈格孢毒素對(duì)水葫蘆都具有致病活性，將毒素溶液放在40W紫外光照射處理2h，然后用針刺法處理水葫蘆葉片，結(jié)果使葉片發(fā)病，這表明短時(shí)間的紫外光照射對(duì)