恩諾沙星對(duì)雞大腸桿菌病的PK-pD同步模型研究.pdf

1、雞大腸桿菌病是由某些毒力血清型大腸埃希菌引起的，血清型復(fù)雜，疫苗預(yù)防效果較差，是危害我國(guó)畜牧業(yè)的重大疾病。恩諾沙星具有抗菌譜廣、吸收迅速、分布廣泛、生物利用度高、毒副作用小等特點(diǎn)而常用于細(xì)菌病的防治。由于臨床上藥物的大量應(yīng)用導(dǎo)致其耐藥性增加，療效降低。PK-PD能夠同時(shí)考慮機(jī)體、菌株、抗生素三者的相互關(guān)系，用于給藥方案的制定。本課題采用臨床致病菌，研究藥動(dòng)學(xué)(PK)以及體外和半體內(nèi)藥效學(xué)(PD)，使用Winnonlin分析恩諾沙星對(duì)大腸

2、埃希菌的藥動(dòng)藥效模型，制定出恩諾沙星治療雞大腸桿菌病的給藥方案，同時(shí)減少耐藥性的產(chǎn)生。
　　1、臨床雞源大腸埃希菌的采集和菌株的篩選
　　對(duì)華中五省進(jìn)行1000株臨床雞大腸埃希菌的采集，分離得到菌株929株，分離率高達(dá)92.9％。測(cè)定恩諾沙星和代謝物環(huán)丙沙星對(duì)分離菌的最小抑菌濃度(MIC)，利用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS對(duì)MIC進(jìn)行分析，得MIC50和MIC90分別為0.5μg/mL和16μg/mL。選取MIC50附近的98株菌進(jìn)行

3、血清型鑒定，對(duì)同時(shí)鑒定出O和K血清型的13菌株進(jìn)行小鼠的致病性試驗(yàn)。結(jié)果安徽112在高中劑量死亡率達(dá)100％毒力較強(qiáng)，故選擇該菌株用于藥效學(xué)研究和疾病模型的構(gòu)建。
　　2、恩諾沙星在雞體內(nèi)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究
　　選用160羽科寶肉雞分為二組，一組攻毒，構(gòu)建大腸埃希菌腹瀉模型，另一組為健康模型。按10mg/kg體重灌胃給藥后在0、0.25h、0.5h、0.75h、1h,1.5h,2h,3h、4h、8h、12h、24h、48h

4、各時(shí)間點(diǎn)取6只雞的血液和腸內(nèi)容物，使用HPLC檢測(cè)。結(jié)果表明:恩諾沙星以其代謝物環(huán)丙沙星在健康模型血漿中濃度之和最高為1.83μg/mL，由于血漿中濃度較低，本課題選擇濃度較高的腸道來進(jìn)行模型擬合。健康雞各時(shí)間點(diǎn)腸道中兩者濃度和分別為:10.16、16.49、21.56、28.54,16.99,15.17,20.71、19.64、11.67、5.33、1.64、0.41μg/mL，患病雞各時(shí)間點(diǎn)腸道中兩者濃度之和分別為:23.42、24

5、.91、29.44、28.61、34.05、31.91、30.12、22.70、21.49、12.71,4.82、0.51μg/mL。藥動(dòng)參數(shù)使用Winnonlin軟件模擬，符合一室有吸收模型。恩諾沙星在雞腸內(nèi)容物中Cmax為28.54～34.05μg/mL;Tmax為1.12～1.23h; T1/2為0.62～0.67h;AUC為228.97～444.85h·μg/mL。將健康和患病藥動(dòng)學(xué)參數(shù)對(duì)比可知，AUC與Cmax在健康和患病雞中

6、差異顯著，Tmax在健康和患病模型中的差異不顯著，原因可能是感染大腸埃希菌后腸道菌群影響了藥物的代謝或者改變了藥物作用機(jī)制有關(guān)酶的活性。
　　3、恩諾沙星對(duì)雞大腸埃希菌的藥效學(xué)研究
　　依據(jù)CLSI(2009)的M07-A9號(hào)文件使用微量肉湯稀釋法測(cè)定恩諾沙星及代謝物環(huán)丙沙星在肉湯和腸道中對(duì)大腸埃希菌的MIC和MBC，結(jié)果恩諾沙星在肉湯和腸道中的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度均分別為0.25μg/mL和0.5μg/mL，環(huán)丙沙星

7、在肉湯中和腸道中的MIC均為0.125μg/mL。表明環(huán)丙沙星有較強(qiáng)的抗菌活性，且恩諾沙星在腸內(nèi)容和MH肉湯中對(duì)大腸埃希菌的殺菌活性基本一致。用棋盤法測(cè)定恩諾沙星和環(huán)丙沙星的聯(lián)合藥敏試驗(yàn)，其FIC=0.125/0.25+0.0625/0.125=1為相加作用。使用去除藥物的方法測(cè)定恩諾沙星對(duì)大腸埃希菌的抗生素后效應(yīng)(PAE)，結(jié)果恩諾沙星對(duì)大腸埃希菌的PAE表現(xiàn)出濃度依賴性。采用平皿涂布法測(cè)定恩諾沙星對(duì)大腸埃希菌的最小防突變濃度(MPC

8、)為7μg/mL。根據(jù)MIC值，配制恩諾沙星濃度為1/2×MIC、1×MIC、2×MIC、4×MIC、8×MIC、16×MIC、32×MIC肉湯繪制體外抑菌曲線。結(jié)果表明恩諾沙星為典型的濃度依賴型，隨著恩諾沙星濃度的加大，抑菌能力增強(qiáng)，時(shí)間縮短。用無菌濾膜將藥動(dòng)實(shí)驗(yàn)各時(shí)間點(diǎn)的腸道內(nèi)容物除菌后，接種大腸埃希菌培養(yǎng)，在0、1、2、4、8、12、24h采用涂板法計(jì)數(shù)，通過每個(gè)點(diǎn)的細(xì)菌數(shù)目得半體內(nèi)抑菌曲線。結(jié)果證明恩諾沙星在半體內(nèi)環(huán)境中同樣表現(xiàn)

9、出濃度依賴性的特征，根據(jù)藥物濃度的不同分別在4h和6h徹底的殺滅細(xì)菌，與體外抑菌曲線基本一致。
　　4耐藥風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估
　　用MH肉湯將恩諾沙星配制為0.125、0.25、0.5、1、2、4、8μg/mL的濃度，接種高濃度的細(xì)菌后培養(yǎng)。不同時(shí)間點(diǎn)取菌液在含恩諾沙星1μg/mL的平皿內(nèi)進(jìn)行菌落數(shù)目的統(tǒng)計(jì)，菌落數(shù)目小于100為自然環(huán)境導(dǎo)致變異，大于100時(shí)為藥物作用導(dǎo)致的變異。結(jié)果顯示，在8μg/mL MPC(7μg/mL)以上濃度

10、培養(yǎng)無耐藥菌產(chǎn)生;在2～4μg/mL濃度培養(yǎng)36h后出現(xiàn)耐藥菌;在0.25μg/mL和1μg/mL最易產(chǎn)生耐藥菌株;低濃度組0.125μg/mL與空白對(duì)照組的耐藥菌生長(zhǎng)基本一致都在24h出現(xiàn)。綜上所述，由于在24h會(huì)出現(xiàn)耐藥菌生長(zhǎng)，所以選擇給藥間隔為24h。
　　5 PK-PD模型的擬合與給藥方案的制定
　　由恩諾沙星抑菌曲線可知恩諾沙星為濃度依賴型藥物，選擇AUC/MIC和Cmax/MIC為擬合參數(shù)。通過Winnonlin

11、分別擬合了AUC/MIC和Cmax/MIC與藥效學(xué)的關(guān)系。發(fā)現(xiàn)兩個(gè)參數(shù)模擬得到的劑量基本相同。根據(jù)文獻(xiàn)調(diào)研AUC/MIC參數(shù)使用較多，故本課題最終選擇AUC/MIC來進(jìn)行模型擬合。健康模型當(dāng)E為0時(shí)表示抑菌、-3為殺菌、-4為根除，其對(duì)應(yīng)的AUC/MIC依次為258.73、451.35、567.39?；伎的Ｐ彤?dāng)E為0時(shí)表示抑菌、-3為殺菌、-4為根除，其對(duì)應(yīng)的AUC/MIC依次為624.94、1065.93、1343.81。依據(jù)劑量計(jì)算

12、公式X=d×AUCex vivo/MICtested/AUCin vivo/MICtarget，當(dāng)臨床菌MIC50=0.503μg/mL，E=0、-3、-4時(shí)，疾病模型對(duì)應(yīng)給藥劑量為7.0、11.9、15.1 mg/kg/d。即大腸桿菌病的預(yù)防按7.0mg/kg bw給藥;治療用藥按11.9mg/kg bw給藥;15.1 mg/kgbw給藥時(shí)可徹底根除細(xì)菌。
　　由于畜禽大規(guī)模養(yǎng)殖，群體給藥公式為D=d×n/W，d為按體重給藥量;

13、W為雞的體重和采食量的轉(zhuǎn)換比，n表示每天給藥次數(shù)，21日齡的小雞對(duì)于W值約為120g/kg/d，n為1?？芍委熑后w給藥量為99mg/kg混飼給藥，每日一次。
　　6模型驗(yàn)證
　　為了驗(yàn)證所得給藥劑量的臨床療效，選24只健康肉雞，人工誘發(fā)大腸桿菌病后隨機(jī)分為兩組。一組為實(shí)驗(yàn)組發(fā)病后，按照11.9mg/kg體重給藥，每日一次，連續(xù)3天。另一組為對(duì)照組，對(duì)照組在構(gòu)建疾病模型后不用藥。結(jié)果:對(duì)照組保護(hù)率為8.3％，實(shí)驗(yàn)組保護(hù)率為8