WNT4基因在子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生發(fā)展中的作用研究.pdf

1、目的:
　　子宮內(nèi)膜異位癥(Endometriosis，EMs)簡稱內(nèi)異癥，是子宮腔以外存在有功能的子宮內(nèi)膜腺體和間質(zhì)而引起的疾病，為育齡婦女的常見病，其發(fā)病率呈上升趨勢，發(fā)病機(jī)制至今仍尚無定論。目前研究表明，內(nèi)異癥患者在位內(nèi)膜細(xì)胞黏附、侵襲、血管形成能力增強(qiáng)，可能為內(nèi)異癥發(fā)病的源頭[1]，但目前關(guān)于內(nèi)異癥發(fā)病的在位內(nèi)膜特異性基因仍不明確。
　　WNT基因是高度保守的發(fā)育基因的大家族，是重要的細(xì)胞信號(hào)分子，WNT基因及其下游

2、通路與細(xì)胞分化、增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移有關(guān)[2]，參與了各種疾病甚至腫瘤的發(fā)病過程[3.4]。WNT的功能與內(nèi)異癥的生物學(xué)行為有共同點(diǎn)，故WNT途徑有可能與內(nèi)異癥發(fā)病有關(guān)，目前相關(guān)研究還很少。WNT4為WNT配體家族的一員，是一種局部作用的信號(hào)分子，參與細(xì)胞分化、增殖、轉(zhuǎn)移等，與細(xì)胞凋亡有關(guān)[5]，WNT4本身在正常子宮內(nèi)膜組織中表達(dá)，與子宮內(nèi)膜的增殖、蛻膜化、著床等功能有關(guān)[6-8]，內(nèi)異癥為內(nèi)膜性病變，當(dāng)內(nèi)膜中生理狀態(tài)WNT基因表達(dá)發(fā)生改

3、變時(shí)可能引起內(nèi)異癥的發(fā)生，本課題組前期對(duì)內(nèi)異癥在位內(nèi)膜基因表達(dá)譜篩查結(jié)果發(fā)現(xiàn)內(nèi)異癥組在位內(nèi)膜WNT4基因表達(dá)明顯下調(diào)，由此我們推測，WNT4基因在在位內(nèi)膜中的表達(dá)異?？赡軈⑴c了內(nèi)異癥的發(fā)病，但需要大樣本病例進(jìn)行驗(yàn)證，此外，WNT4在內(nèi)異癥發(fā)病過程中如何發(fā)揮作用，是否通過調(diào)控細(xì)胞增殖、侵襲及凋亡而參與了內(nèi)異癥的發(fā)病還需要進(jìn)一步研究。
　　方法:
　　一、WNT4在子宮內(nèi)膜異位癥異位病灶及在位內(nèi)膜中的表達(dá)意義
　　1、應(yīng)用

4、熒光定量PCR(Real Time PCR)方法檢測內(nèi)異癥異位病灶及在位內(nèi)膜中WNT4 mRNA的表達(dá)水平;
　　2、應(yīng)用免疫組化及蛋白免疫印跡技術(shù)(Western blotting)檢測內(nèi)異癥異位病灶及在位內(nèi)膜中WNT4蛋白表達(dá)。
　　二、WNT4基因在子宮內(nèi)膜異位癥在位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞(ESC)中的表達(dá)及對(duì)其生物學(xué)活性的影響作用
　　1、原代培養(yǎng)ESC及對(duì)照組在位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞(NSC)。
　　2、免疫細(xì)胞化學(xué)染色

5、鑒定細(xì)胞。
　　3、構(gòu)建pEGFP-N1-WNT4重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染ESC。
　　4、靶向NSC中WNT4基因的RNA干擾:構(gòu)建3個(gè)WNT4 shRNA表達(dá)載體pGCsi-WNT4-s1、pGCsi-WNT4-s2和pGCsi-WNT4-s3。
　　5、Real time PCR檢測轉(zhuǎn)染W(wǎng)NT4基因重組質(zhì)粒及WNT4 RNA干擾質(zhì)粒后ESC和NSC中WNT4 mRNA表達(dá)水平。
　　6、Western Blotting

6、檢測轉(zhuǎn)染W(wǎng)NT4重組質(zhì)粒及WNT4 RNA干擾質(zhì)粒后ESC和NSC中WNT4蛋白表達(dá)水平。
　　7、CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測WNT4基因表達(dá)改變前后各組細(xì)胞增殖能力的改變。
　　8、應(yīng)用AnnexinⅤ-APC/7-AAD凋亡檢測試劑盒檢測WNT4基因表達(dá)改變前后各組細(xì)胞凋亡率的改變。
　　9、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測WNT4表達(dá)改變前后MMP-9在培養(yǎng)上清中的含量變化。
　　結(jié)果:
　　一、W

7、NT4在子宮內(nèi)膜異位癥異位病灶及在位內(nèi)膜中的表達(dá)
　　1、Real time PCR結(jié)果顯示，將對(duì)照組子宮內(nèi)膜WNT4 mRNA相對(duì)表達(dá)水平的平均值設(shè)為1，相對(duì)于此平均值，內(nèi)異癥組在位內(nèi)膜(EMs)和異位病灶(Ec)中WNT4 mRNA相對(duì)表達(dá)水平(2-ΔΔCt)分別為0.64±0.07(P＜0.01)和0.62±0.05(P＜0.01)，明顯低于對(duì)照組子宮內(nèi)膜1.04±0.12，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。內(nèi)異癥組增殖期(PE)和分泌期

8、(SE)內(nèi)膜WNT4 mRNA相對(duì)表達(dá)水平分別與對(duì)照組增殖期和分泌期內(nèi)膜比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。內(nèi)異癥組在位內(nèi)膜和異位病灶中WNT4 mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　2、免疫組化實(shí)驗(yàn)表明WNT4在子宮內(nèi)膜組織的腺體和間質(zhì)細(xì)胞都表達(dá)，內(nèi)異癥在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜WNT4蛋白表達(dá)陽性率分別為36.7％和30.0％，明顯低于對(duì)照組子宮內(nèi)膜，66.7％(P＜0.05)。內(nèi)異癥組增殖期和分泌期在位內(nèi)膜WN

9、T4蛋白表達(dá)陽性率明顯低于對(duì)照組增殖期和分泌期子宮內(nèi)膜(P＜0.05)。內(nèi)異癥在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜WNT4蛋白表達(dá)陽性率差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，同組內(nèi)增殖期和分泌期比較差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　3、Western blotting結(jié)果顯示:將對(duì)照組子宮內(nèi)膜WNT4蛋白相對(duì)表達(dá)水平的平均值設(shè)為1，相對(duì)于此平均值，內(nèi)異癥在位內(nèi)膜組(EMs)和異位病灶(Ec)WNT4蛋白相對(duì)表達(dá)水平分別為0.60±0.13和0.62±0.10，低

10、于對(duì)照組子宮內(nèi)膜1.00±0.14(P＜0.05)。內(nèi)異癥組增殖期(PE)和分泌期(SE)內(nèi)膜WNT4蛋白相對(duì)表達(dá)水平分別與對(duì)照組增殖期和分泌期內(nèi)膜比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。內(nèi)異癥組在位內(nèi)膜和異位病灶中WNT4蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　二、WNT4基因在子宮內(nèi)膜異位癥在位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞(ESC)中的表達(dá)及對(duì)其生物學(xué)活性的影響作用
　　1、體外成功分離和培養(yǎng)了子宮內(nèi)膜異位癥在位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞

11、(ESC)及正常內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞(NSC)。
　　2、免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定結(jié)果表明細(xì)胞波形蛋白染色陽性，CD10染色陽性，角蛋白、Ⅷ因子及白細(xì)胞共同抗原染色均陰性，證實(shí)為子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞。
　　3、構(gòu)建了三個(gè)靶向WNT4基因的shRNA表達(dá)載體pGCsi-WNT4-s1、pGCsi-WNT4-s2和pGCsi-WNT4-s3及pEGFP-N1-WNT4重組質(zhì)粒。
　　4、實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示:基礎(chǔ)狀態(tài)下，ESC組WN

12、T4 mRNA相對(duì)水平（2-ΔΔCt，0.67±0.04）明顯低于NSC組（1.02±0.11），P＜0.01。ESC轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-WNT4質(zhì)粒組WNT4 mRNA相對(duì)水平為0.94±0.11，顯著高于ESC組(P＜0.05)。ESC轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-V質(zhì)粒組WNT4 mRNA相對(duì)水平為0.66±0.06，與ESC組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。pGCsi-WNT4-s1、pGCsi-WNT4-s2和pGCsi-WN

13、T4-s3組WNT4 mRNA相對(duì)水平分別為0.55±0.06、0.71±0.07和0.70±0.06，與NSC組比較明顯降低(P＜0.05)。其中pGCsi-WNT4-s1組WNT4mRNA相對(duì)水平最低(P＜0.01)。 NSC轉(zhuǎn)染pGCsi-V質(zhì)粒組WNT4 mRNA相對(duì)水平為0.99±0.11，與NSC組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　5、蛋白免疫印跡結(jié)果顯示:基礎(chǔ)狀態(tài)下，ESC組WNT4蛋白相對(duì)水平（WNT4/

14、GAPDH，0.51±0.10）顯著低于NSC組（1.00±0.16），P＜0.05。ESC轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-WNT4質(zhì)粒組WNT4蛋白相對(duì)水平為0.94±0.11，顯著高于ESC組(P＜0.05)。ESC轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-V質(zhì)粒組WNT4蛋白相對(duì)水平為0.53±0.09，與ESC比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。pGCsi-WNT4-s1、pGCsi-WNT4-s2和pGCsi-WNT4-s3組WNT4蛋白相對(duì)水平分別為0

15、.51±0.10、0.61±0.11和0.60±0.12，與ESC組比較明顯降低(P＜0.05)。其中pGCsi-WNT4-s1組WNT4蛋白相對(duì)水平最低。NSC轉(zhuǎn)染pGCsi-V質(zhì)粒組WNT4蛋白相對(duì)水平為1.05±0.17，與NSC組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　6、CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)繪制細(xì)胞生長曲線顯示:基礎(chǔ)狀態(tài)下，ESC組在24h、48h、72h和96h各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的相對(duì)增殖能力明顯高于NSC組相應(yīng)各時(shí)間點(diǎn)

16、的增殖能力(P＜0.05)。上調(diào)ESC WNT4基因表達(dá)即ESC轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-WNT4質(zhì)粒后，ESC在48h、72h和96h各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的相對(duì)增殖能力明顯降低，明顯低于ESC組對(duì)應(yīng)各時(shí)間點(diǎn)的增殖能力(P＜0.01)。ESC轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組（pEGFP-N1-V）在24h、48h、72h和96h各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的相對(duì)增殖能力與ESC組相應(yīng)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)增殖能力比較差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。使NSC WNT4基因沉默即轉(zhuǎn)染pGCsi-WNT

17、4-s1質(zhì)粒后，48h、72h和96h各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞相對(duì)增殖能力明顯升高，與NSC組對(duì)應(yīng)各時(shí)間點(diǎn)的增殖能力比較(P＜0.01)。NSC轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組在24h、48h、72h和96h各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的相對(duì)增殖能力與NSC組相應(yīng)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)增殖能力比較差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、WNT4基因在正常子宮內(nèi)膜的增殖期和分泌期均有表達(dá)，內(nèi)異癥異位病灶及在位內(nèi)膜中WNT4表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組子宮內(nèi)膜，WNT4的異常