siRNA沉默Cdc2的表達對骨肉瘤MG63增殖及凋亡的影響.pdf

1、目的: Cdc2基因所編碼的蛋白是一種重要的細胞周期蛋白,在包括骨肉瘤MG63細胞的大多數(shù)腫瘤細胞中呈高表達。在本研究中采用siRNA干擾技術,抑制骨肉瘤MG63細胞中Cdc2基因的表達,觀察Cdc2基因表達抑制后對MG63細胞增殖及凋亡的影響。
　　方法:構建針對Cdc2基因表達的特異性siRNA表達質粒psilencer2.1-U6/Cdc2及對照psilencer2.1-U6/scramble質粒,通過脂質體介導穩(wěn)定轉染入人

2、骨肉瘤MG63細胞株,通過Western blotting和定量PCR檢測MG63細胞中Cdc2在蛋白和mRNA水平的表達情況,免疫熒光進一步檢測細胞形態(tài)變化和Cdc2表達的情況,MTT法和流式細胞術檢測psilencer2.1-U6/Cdc2對MG63細胞增殖能力和細胞周期的影響,Western blotting檢測細胞凋亡蛋白Bcl-2,Bax的表達情況。
　　結果:(1)經(jīng)重組質粒DNA經(jīng)測序鑒定,成功構建了pSilence

3、r2.1/SiRNA重組質粒(2)將所構建的pSilencer2.1/SiRNA重組質粒分別轉染骨肉瘤MG63細胞, hygromycin篩選陽性細胞克隆,經(jīng)Western blotting和RT-PCR法檢測結果表明,成功獲得穩(wěn)定轉染psilencer2.1-U6/Cdc2質粒的MG63細胞(MG63-SiRNA/Cdc2),和陰性對照細胞(MG63-SiRNA/Scramble),并通過灰度分析發(fā)現(xiàn),MG63-SiRNA/Cdc2細

4、胞中Cdc2mRNA和蛋白表達與MG63-SiRNA/Scramble細胞相比沉默效率分別為86％和89％。(3)MTT法檢測發(fā)現(xiàn)干擾Cdc2的表達可以抑制MG63細胞的增殖,流式細胞術檢測細胞主要易聚積于G2/M期, G0/G1期,同時S期細胞減少。Western blotting檢測發(fā)現(xiàn),干擾Cdc2基因的表達對MG63細胞中的凋亡蛋白Bcl-2,Bax的表達影響不大。
　　結論: Cdc2基因可能參與了腫瘤的發(fā)生過程,并與腫