乙型肝炎病毒（HBV）顆粒性抗原轉(zhuǎn)基因番茄植株的構(gòu)建及鑒定.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、該研究通過以HBc為載體的HBV preS/S番茄疫苗的研究,探討HBV轉(zhuǎn)基因番茄作為口服疫苗的可行性,為HBV的預(yù)防探討一條新的途徑.先把preS/S基因插入到HBc的第73-94aa處(棘突尖部),構(gòu)建了顆粒性表達(dá)載體HBc-Hbs;隨后將目的基因克隆到植物表達(dá)載體pBIN438上,液氮凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌eha105;用含pBIN438-HBc-Hbs的根癌農(nóng)桿菌侵染番茄2/3子葉和下胚軸;在MS<,2>培養(yǎng)基上培養(yǎng)大約35d,在愈傷

2、組織處可見分化苗;待苗長到3cm時(shí),移到MS<,3>培養(yǎng)基上,根系發(fā)達(dá)后,將完整的植株移栽到土壤中室溫生長,共獲得67株抗性植株.CTAB法提取植物總DNA,PCR方法鑒定外源HBc-Hbs基因(1177bp),34株為陽性.考慮到PCR方法的假陽性,進(jìn)行了PCR-Southernnblot檢測;為進(jìn)一步證明HBc-Hbs基因的整合情況,將植物總DNA BamHI酶切過夜;同時(shí)設(shè)立經(jīng)相同酶切的重組質(zhì)粒pBIN438-HBc-Hbs為陽性

3、對照,以非轉(zhuǎn)化植株為陰性對照;根據(jù)顆粒性表達(dá)載體HBc-Hbs兩端序列設(shè)計(jì)引物P1和P2,以質(zhì)粒pBIN438-HBc-Hbs為模板,用地高辛標(biāo)記探針進(jìn)行Southern blot雜交分析;通過RT-PCR及Westen blot印跡雜交檢測目的基因在番茄中的轉(zhuǎn)錄和翻譯情況.PCR、PCR-Southern blot、Southern blot結(jié)果表明目的基因已整合到番茄的基因組中;RT-PCR、Western blot的結(jié)果證明目的基

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