與凋亡相關的斑點樣蛋白（ASC）在大鼠急性胰腺炎中的作用機制.pdf

1、目的：研究大鼠發(fā)生急性胰腺炎時，與凋亡相關的斑點樣蛋白(ASC)在胰腺組織的表達及其與caspase-1和IL-1β的關系；研究ASC在巨噬細胞系P388D1細胞中的表達情況，為評價ASC在大鼠急性胰腺炎時的作用機制提供實驗依據(jù)。 方法：(1)將20只健康、成年的SD大鼠隨機分成兩組，一組用5％去氧膽酸鈉逆行注入大鼠胰膽管進行急性胰腺炎造模，另一組作為正常對照組。造模24小時后處死大鼠，取大鼠新鮮血清，通過全自動生化分析儀檢測大

2、鼠血清淀粉酶活性；用ELISA法測定血清IL-1β含量。取大鼠胰腺組織經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋，做成蠟塊后連續(xù)切片，用免疫組化LAB法檢測ASC和caspase-1在胰腺組織中的表達，將染色的切片置于Olympus多功能顯微鏡觀察并攝像，應用CA6300彩色圖像分析系統(tǒng)進行定量灰度掃描，求出給定面積內的灰度值，比較急性胰腺炎組和正常對照組間ASC和caspase-1兩項指標表達的差異。(2)制備感受態(tài)的DH5α大腸桿菌，將帶有綠色和紅色

3、熒光的質粒pEGFP-ASC-C2和pDsRed2-ASC-C1分別轉染大腸桿菌表達，培養(yǎng)細菌進行質粒的擴增，應用大連寶生物公司生產的試劑盒、采用SDS堿裂解法提取和純化質粒。(3)復蘇巨噬細胞系P388D1細胞，加入1640培養(yǎng)液約10ml混勻，分裝至兩個無菌培養(yǎng)瓶中，37℃，5％CO<,2>培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時。從培養(yǎng)瓶中取出300μ1細胞液加到24孔培養(yǎng)板中匯片，置37℃，5％CO<,2>培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。在倒置顯微鏡下觀察，

4、當細胞覆蓋至小孔底部一半時使用大連寶生物公司生產的轉染試劑盒將純化的pEGFP-ASC-C2和pDsRed2-ASC-Cl質粒分別轉染至該細胞中繼續(xù)培養(yǎng)24小時，最后涂片后進行熒光拍照，觀察質粒在P388D1細胞中的表達情況。 結果：(1)急性胰腺炎組血清淀粉酶水平(77632±5934nknt/L)較正常對照組水平(16303±1450nkat/L)顯著升高，兩者間的差異在統(tǒng)計學上有意義(p<0.01)；急性胰腺炎組IL-1β

5、水平(386.26±50.54ng/L)較正常對照組水平(99.11±18.43ng/L)顯著升高，兩者間的差異在統(tǒng)計學上有意義(p<0.01)。(2)免疫組化檢測、分析發(fā)現(xiàn)：ASC和caspase-1在正常對照組大鼠胰腺組織中少量表達，在急性胰腺炎組表達顯著增加，兩組間灰度值(24.86±523vs54.12±7.91和35.46±4.21vs65.32±8.10)的差異在統(tǒng)計學上均有意義(p<0.01)。(3)在巨噬細胞系P388D